MicroRNA—29a在脂多糖诱导人单核细胞凋亡中的作用和机制(3)
1.2.6 RNA提取及real time RT-PCR 细胞总 RNA 提取按 Trizol 试剂盒说明书操作；使用invitrogen的逆转录反应试剂盒，按试剂盒说明书进行，反应产物置于-20 ℃保存备用或立即进行PCR扩增；PCR过程按invitrogen的SYBR Green qPCR 试剂盒说明书在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行，使用18S作为内参照同时进行PCR，获得Ct值后，应用比较Ct法进行相对定量，目标基因的相对定量用2-△△Ct计算。
1.2.7 细胞凋亡水平检测(Annexin V-FITC 染色法) 收集细胞时直接将悬浮生长的THP-1细胞轻轻吹打混匀，收集细胞悬液，500 r/min 4 ℃离心10 min，弃上清液。将细胞悬于标记缓冲液中。然后，加入 Annexin V-FITC，避光室温反应 15 min。加入标记缓冲液，用流式细胞仪观察细胞凋亡情况。
1.3 统计学方法
, 百拇医药
采用SPSS 13.0 统计软件进行数据的分析处理，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，组间差异只有两组时用成组t检验，有多组时用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 过表达miR-29a促进THP-1细胞凋亡
THP-1细胞转染miR-29a mimic 100 nmol/L后，经流式细胞仪检测，与NC组比较，细胞存活率由82.62%下降至57.94%，提示THP-1细胞过表达miR-29a可导致细胞凋亡水平增加(图1)。
2.2 下调miR-29a的表达水平能抑制LPS诱导的THP-1细胞凋亡
THP-1细胞先转染miR-29a 的抑制剂100 nmol/L，24 h后再用LPS(1 μg/ml)诱导，与单纯用LPS(1 μg/ml)诱导比较，抑制剂组细胞的存活率增高(由48.50%提高至61.91%)，提示下调THP-1细胞miR-29a的表达水平可抑制LPS诱导的细胞凋亡(图2)。
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2.3 过表达miR-29a后 Bcl-2 和Mcl-1的表达下降
THP-1细胞转染miR-29a 100 nmol/L 48 h后，用real time RT-PCR检测Bcl-2 和Mcl-1 mRNA的表达水平，结果提示，与CON组和NC组比较，Bcl-2 和Mcl-1的mRNA表达水平均下降，降至(0.55±0.12)和(0.65±0.06)，P<0.05，提示过表达miR-29a，能使 Bcl-2 和Mcl-1的表达水平下降(图3)。
2.4 双荧光素酶报告基因系统验证miR-29a的靶基因
293T细胞同时转染miR-29a的mimics和Bcl-2 (或Mcl-1)的报告基因载体(Wt野生型和Mut突变体)，结果显示，与对照组比较，转染Bcl-2或Mcl-1野生型(Wt)载体的细胞荧光素酶活性下降，分别由(1.07±0.18)和(1.00±0.03)降至(0.63±0.12)和(0.58±0.10)，P<0.05，而突变型载体(Mut)未见变化(P>0.05)。结果提示miR-29a能特异性地与Bcl-2和Mcl-1基因的3’UTR的种子序列结合，降解Bcl-2和Mcl-1的mRNA(图4)。
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3 讨论
脓毒症的发病机制异常复杂，涉及感染、炎症、免疫、凝血、细胞凋亡以及神经-内分泌异常等一系列问题，并与机体多系统、多器官病理生理改变密切相关[7]。免疫功能紊乱尤其是免疫功能抑制被认为是脓毒症发病的重要环节，其中免疫细胞凋亡是脓毒症免疫抑制状态发生的一个重要机制，直接影响脓毒症患者的转归和预后[8]，可能为临床干预提供新的靶点和契机。Hotchkiss等[9]发现，通过脓毒症鼠过度表达Bcl-2基因，几乎可以完全阻止脓毒症所诱导的淋巴细胞凋亡。由此预测，调控Bcl-2相关的细胞凋亡过程，有可能改变脓毒症的免疫功能状态。
miRNAs是一类长度约22个核苷酸大小的内源性非编码RNA，它可通过识别靶基因mRNA的3’端非编码区(3’UTR)，并与之结合阻止翻译或导致mRNA降解，从而抑制靶基因的表达[10-12]。Taganov等[13]用LPS刺激人单核细胞，miRNA芯片检测发现miR-146a、miR-155和miR-132的表达量增高，并证实LPS是通过TLR4的信号通路调控miRNAs的表达变化，其中miR-146a是以IRAK-1(IL-1受体相关激酶1)和TRAF6(TNF受体相关因子6为靶点，通过调节NF-κB来实现对TLR4/IL-4信号途径的负调控；曾振国等[14]研究应用LPS刺激NR8383肺泡巨噬细胞，miR-146a的表达上调，且随着刺激时间的延长，miR-146a的表达有增高的趋势。Pauley等[15]则通过转染miR-146a拟似物进入THP-1细胞，证实可以下调由LPS诱导的细胞因子表达，但关于miRNA对脓毒症的发病过程的报道目前仍较缺乏。
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Xiong等[6]的研究结果表明，miR-29参与肿瘤细胞的凋亡调控，在肝癌细胞中miR-29的表达水平降低，在肝癌细胞中过表达miR-29能促进肝癌细胞的凋亡，但miR-29能否调控免疫细胞凋亡，目前国内外未见报道。本实验先用LPS 诱导THP-1 细胞，能使细胞的凋亡水平增高，证实LPS能诱导THP-1 细胞凋亡。再通过细胞转染的方法，将合成的miR-29a的拟似物导入THP-1细胞中，达到过表达miR-29a的目的，结果显示THP-1的细胞凋亡水平增高，这与LPS诱导THP-1 细胞凋亡的效应类似；接着，THP-1 细胞先转染miR-29a 的inhibitor，阻断细胞内miR-29a的作用，再用LPS诱导细胞，结果细胞凋亡水平较单纯用LPS刺激降低，提示阻遏miR-29a的作用，能抑制LPS诱导的细胞凋亡。本研究应用生物信息学软件Targetscan，寻找miR-29a直接作用的靶点，发现抗凋亡基因Bcl-2 和Mcl-1的mRNA序列中，它们的3’UTR非编码区有能与miR-29a结合的种子序列，因此，在THP-1中过表达miR-29a后，用real time RT-PCR方法检测Bcl-2 和Mcl-1 mRNA表达水平，结果发现它们的表达水平下降，提示过表达miR-29a能抑制Bcl-2 和Mcl-1表达；Luciferase 实验证实，miR-29a可特异性抑制带有 Bcl-2 和Mcl-1 3’UTR上野生型识别元件的报告基因表达(P<0.05)，证实了Bcl-2 和Mcl-1是miR-29a的靶基因，这与Xiong等[6]的研究结果一致。
, http://www.100md.com(熊旭明 张振辉 江子欣 陈伟燕 杨其霖 刘卫江)
1.2.7 细胞凋亡水平检测(Annexin V-FITC 染色法) 收集细胞时直接将悬浮生长的THP-1细胞轻轻吹打混匀，收集细胞悬液，500 r/min 4 ℃离心10 min，弃上清液。将细胞悬于标记缓冲液中。然后，加入 Annexin V-FITC，避光室温反应 15 min。加入标记缓冲液，用流式细胞仪观察细胞凋亡情况。
1.3 统计学方法
, 百拇医药
采用SPSS 13.0 统计软件进行数据的分析处理，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，组间差异只有两组时用成组t检验，有多组时用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 过表达miR-29a促进THP-1细胞凋亡
THP-1细胞转染miR-29a mimic 100 nmol/L后，经流式细胞仪检测，与NC组比较，细胞存活率由82.62%下降至57.94%，提示THP-1细胞过表达miR-29a可导致细胞凋亡水平增加(图1)。
2.2 下调miR-29a的表达水平能抑制LPS诱导的THP-1细胞凋亡
THP-1细胞先转染miR-29a 的抑制剂100 nmol/L，24 h后再用LPS(1 μg/ml)诱导，与单纯用LPS(1 μg/ml)诱导比较，抑制剂组细胞的存活率增高(由48.50%提高至61.91%)，提示下调THP-1细胞miR-29a的表达水平可抑制LPS诱导的细胞凋亡(图2)。
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2.3 过表达miR-29a后 Bcl-2 和Mcl-1的表达下降
THP-1细胞转染miR-29a 100 nmol/L 48 h后，用real time RT-PCR检测Bcl-2 和Mcl-1 mRNA的表达水平，结果提示，与CON组和NC组比较，Bcl-2 和Mcl-1的mRNA表达水平均下降，降至(0.55±0.12)和(0.65±0.06)，P<0.05，提示过表达miR-29a，能使 Bcl-2 和Mcl-1的表达水平下降(图3)。
2.4 双荧光素酶报告基因系统验证miR-29a的靶基因
293T细胞同时转染miR-29a的mimics和Bcl-2 (或Mcl-1)的报告基因载体(Wt野生型和Mut突变体)，结果显示，与对照组比较，转染Bcl-2或Mcl-1野生型(Wt)载体的细胞荧光素酶活性下降，分别由(1.07±0.18)和(1.00±0.03)降至(0.63±0.12)和(0.58±0.10)，P<0.05，而突变型载体(Mut)未见变化(P>0.05)。结果提示miR-29a能特异性地与Bcl-2和Mcl-1基因的3’UTR的种子序列结合，降解Bcl-2和Mcl-1的mRNA(图4)。
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3 讨论
脓毒症的发病机制异常复杂，涉及感染、炎症、免疫、凝血、细胞凋亡以及神经-内分泌异常等一系列问题，并与机体多系统、多器官病理生理改变密切相关[7]。免疫功能紊乱尤其是免疫功能抑制被认为是脓毒症发病的重要环节，其中免疫细胞凋亡是脓毒症免疫抑制状态发生的一个重要机制，直接影响脓毒症患者的转归和预后[8]，可能为临床干预提供新的靶点和契机。Hotchkiss等[9]发现，通过脓毒症鼠过度表达Bcl-2基因，几乎可以完全阻止脓毒症所诱导的淋巴细胞凋亡。由此预测，调控Bcl-2相关的细胞凋亡过程，有可能改变脓毒症的免疫功能状态。
miRNAs是一类长度约22个核苷酸大小的内源性非编码RNA，它可通过识别靶基因mRNA的3’端非编码区(3’UTR)，并与之结合阻止翻译或导致mRNA降解，从而抑制靶基因的表达[10-12]。Taganov等[13]用LPS刺激人单核细胞，miRNA芯片检测发现miR-146a、miR-155和miR-132的表达量增高，并证实LPS是通过TLR4的信号通路调控miRNAs的表达变化，其中miR-146a是以IRAK-1(IL-1受体相关激酶1)和TRAF6(TNF受体相关因子6为靶点，通过调节NF-κB来实现对TLR4/IL-4信号途径的负调控；曾振国等[14]研究应用LPS刺激NR8383肺泡巨噬细胞，miR-146a的表达上调，且随着刺激时间的延长，miR-146a的表达有增高的趋势。Pauley等[15]则通过转染miR-146a拟似物进入THP-1细胞，证实可以下调由LPS诱导的细胞因子表达，但关于miRNA对脓毒症的发病过程的报道目前仍较缺乏。
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Xiong等[6]的研究结果表明，miR-29参与肿瘤细胞的凋亡调控，在肝癌细胞中miR-29的表达水平降低，在肝癌细胞中过表达miR-29能促进肝癌细胞的凋亡，但miR-29能否调控免疫细胞凋亡，目前国内外未见报道。本实验先用LPS 诱导THP-1 细胞，能使细胞的凋亡水平增高，证实LPS能诱导THP-1 细胞凋亡。再通过细胞转染的方法，将合成的miR-29a的拟似物导入THP-1细胞中，达到过表达miR-29a的目的，结果显示THP-1的细胞凋亡水平增高，这与LPS诱导THP-1 细胞凋亡的效应类似；接着，THP-1 细胞先转染miR-29a 的inhibitor，阻断细胞内miR-29a的作用，再用LPS诱导细胞，结果细胞凋亡水平较单纯用LPS刺激降低，提示阻遏miR-29a的作用，能抑制LPS诱导的细胞凋亡。本研究应用生物信息学软件Targetscan，寻找miR-29a直接作用的靶点，发现抗凋亡基因Bcl-2 和Mcl-1的mRNA序列中，它们的3’UTR非编码区有能与miR-29a结合的种子序列，因此，在THP-1中过表达miR-29a后，用real time RT-PCR方法检测Bcl-2 和Mcl-1 mRNA表达水平，结果发现它们的表达水平下降，提示过表达miR-29a能抑制Bcl-2 和Mcl-1表达；Luciferase 实验证实，miR-29a可特异性抑制带有 Bcl-2 和Mcl-1 3’UTR上野生型识别元件的报告基因表达(P<0.05)，证实了Bcl-2 和Mcl-1是miR-29a的靶基因，这与Xiong等[6]的研究结果一致。
, http://www.100md.com(熊旭明 张振辉 江子欣 陈伟燕 杨其霖 刘卫江)