TNF—α通过PKCα信号通路诱导人系膜细胞IP3R1表达(3)
NA的相对表达量=IP3R1基因拷贝数/GAPDH基因拷贝数，校正结果以T0 h为1，其余组与之比较。
1.4 Western印迹
提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF膜后加一抗孵育过夜；加二抗室温孵育2 h；TBST洗膜3次，ECL发光法检测。以相对分子质量45 000的β-actin作为内参，应用数码凝胶成像软件分析。目的蛋白质量浓度=目的蛋白灰度值/同一样本β-actin灰度值。
1.5 PKC活性检测
按pepTag?non-radioactive PKC assay操作说明于冰上建立反应体系：即在1 ml离心管中(含特异性PKC-α纯化蛋白)，分别加入PKC reaction 5×buffer 5 μl， C1 Peptide 5 μl，超声乳化的PKC activator 5×solution(1 mg/ml磷脂酰丝氨酸)5 μl，Peptide protection solution 1 μl，30 ℃水浴反应30 min，95 ℃灭活10 min，加1 μl 80%甘油，0.8%琼脂糖-50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)灌胶，将梳子置于胶的中央，以利于活化带与非活化带分别向阳极和阴极移动。电泳液为50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，100 V电泳15 min，紫外灯下数码凝胶成像并分析，进行组间比较。
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1.6 统计学方法
采用SPSS 13.0软件分析，计量资料以均值±标准差(x±s)表示，计量资料各组间的比较采用方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 TNF-α对IP3R1 mRNA和蛋白表达的影响
实时定量PCR检测结果表明，100 ng/mL的TNF-α处理HMCs 2 h后即可观察到IP3R1 mRNA表达上调，于8 h达高峰(P<0.01)，而在24 h 有所下降(P<0.01)，见表1。Western检查结果表明，100 ng/mL的TNF-α处理HMCs 4 h后即可观察到IP3R1蛋白表达的上调，至24 h IP3R1蛋白升高达高峰(P<0.01)见图1，表2。
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2.2 多种信号抑制剂对TNF-α诱导IP3R1mRNA和蛋白表达的影响
实时定量PCR检测结果表明，8h组与0 h组比较，IP3R1mRNA的表达明显增加(P<0.01)；各种抑制剂单独处理HMCs后检测IP3R1mRNA表达的相对定量结果，显示IP3R1mRNA的表达与0 h组比较差异无统计学意义(P>0.05)，表明了这些抑制剂对IP3R1mRNA基线表达水平无明显影响，见表3。与8h组比较，抑制剂+TNF-α各组中，Sa+T组和d609+T组IP3R1mRNA的表达明显下降，差异具有统计学意义[(3.30±0.81 )vs. (1.95±0.13)，P<0.05；(2.10±0.49)，P<0.01]，见表3。而在其他抑制剂+T组：U+T，PP1+T，Rot+T组，IP3R1 mRNA的表达无明显变化(P>0.05)见表3，表明Safingol和D609可阻断TNF-α对IP3R1 mRNA表达的上调， 说明PC-PLC和PKCα可能参与人系膜细胞中TNF-α上调IP3R1mRNA的表达。免疫印迹结果与实时定量PCR结果是一致的，与24 h相比，在Safingol和D609预处理组，IP3R1蛋白的表达明显下降[(3.09±0.13) vs. (1.86+0.39)，P<0.01；(1.98±0.02)，P<0.01]，见图2，表4。表明Safingol和D609可阻断TNF-α对IP3R1蛋白表达的上调，进一步说明PC-PLC和PKC-α参与了系膜细胞中TNF-α促进IP3R1蛋白的表达。
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2.3 PKC-α活性检测
TNF-α处理0、4、8、24 h各组在阳极均可见特异性比较微弱的磷酸化条带；而TNF-α处理8 h磷酸化条带密度及宽度明显增强。说明TNF-α处理8 h，PKC-α的活化最强。而D609或Safingol预处理后，与8h组比较，PKC-α磷酸化条带明显减弱。表明D609 和Safingol可阻断TNF-α对PKC-α的活化。
3 讨论
IP3R是对第二信使IP3应答的一种普遍存在的胞内Ca2+释放通道，它在调节如受精、细胞收缩、增殖、神经信号传递等多种生物细胞功能活动中发挥重要作用。肾脏IP3R1主要存在于肾小球系膜细胞、血管平滑肌细胞[10] 。
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研究表明，胞内IP3R1表达增加，可能与房颤和哮喘及阿尔茨海默及帕金森氏病发病机制密切有关[5-7]；Wen等[11]和王静艳等[12]发现在肝硬化动物模型中，肾小球系膜细胞和入球小动脉平滑肌中IP3R1表达明显增加可能与肾脏低灌注有关[11-12]；而转化生长因子β下调IP3R1而降低GMCs和肾脏平滑肌的敏感性，与糖尿病肾脏低灌注进而发展成糖尿病肾病直接相关[13]。以上资料表明 IP3R数目和结构的变化可能会影响细胞内Ca2+信号的幅度和频率，将会导致细胞收缩功能紊乱。因此认为肾脏IP3R1表达的多少可能与肾脏对缩血管物质的敏感性有着密切联系，进而参与HRS发生与发展。
, 百拇医药(王育蓉 章欢 孙辉 刘沛)
1.4 Western印迹
提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF膜后加一抗孵育过夜；加二抗室温孵育2 h；TBST洗膜3次，ECL发光法检测。以相对分子质量45 000的β-actin作为内参，应用数码凝胶成像软件分析。目的蛋白质量浓度=目的蛋白灰度值/同一样本β-actin灰度值。
1.5 PKC活性检测
按pepTag?non-radioactive PKC assay操作说明于冰上建立反应体系：即在1 ml离心管中(含特异性PKC-α纯化蛋白)，分别加入PKC reaction 5×buffer 5 μl， C1 Peptide 5 μl，超声乳化的PKC activator 5×solution(1 mg/ml磷脂酰丝氨酸)5 μl，Peptide protection solution 1 μl，30 ℃水浴反应30 min，95 ℃灭活10 min，加1 μl 80%甘油，0.8%琼脂糖-50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)灌胶，将梳子置于胶的中央，以利于活化带与非活化带分别向阳极和阴极移动。电泳液为50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，100 V电泳15 min，紫外灯下数码凝胶成像并分析，进行组间比较。
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1.6 统计学方法
采用SPSS 13.0软件分析，计量资料以均值±标准差(x±s)表示，计量资料各组间的比较采用方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 TNF-α对IP3R1 mRNA和蛋白表达的影响
实时定量PCR检测结果表明，100 ng/mL的TNF-α处理HMCs 2 h后即可观察到IP3R1 mRNA表达上调，于8 h达高峰(P<0.01)，而在24 h 有所下降(P<0.01)，见表1。Western检查结果表明，100 ng/mL的TNF-α处理HMCs 4 h后即可观察到IP3R1蛋白表达的上调，至24 h IP3R1蛋白升高达高峰(P<0.01)见图1，表2。
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2.2 多种信号抑制剂对TNF-α诱导IP3R1mRNA和蛋白表达的影响
实时定量PCR检测结果表明，8h组与0 h组比较，IP3R1mRNA的表达明显增加(P<0.01)；各种抑制剂单独处理HMCs后检测IP3R1mRNA表达的相对定量结果，显示IP3R1mRNA的表达与0 h组比较差异无统计学意义(P>0.05)，表明了这些抑制剂对IP3R1mRNA基线表达水平无明显影响，见表3。与8h组比较，抑制剂+TNF-α各组中，Sa+T组和d609+T组IP3R1mRNA的表达明显下降，差异具有统计学意义[(3.30±0.81 )vs. (1.95±0.13)，P<0.05；(2.10±0.49)，P<0.01]，见表3。而在其他抑制剂+T组：U+T，PP1+T，Rot+T组，IP3R1 mRNA的表达无明显变化(P>0.05)见表3，表明Safingol和D609可阻断TNF-α对IP3R1 mRNA表达的上调， 说明PC-PLC和PKCα可能参与人系膜细胞中TNF-α上调IP3R1mRNA的表达。免疫印迹结果与实时定量PCR结果是一致的，与24 h相比，在Safingol和D609预处理组，IP3R1蛋白的表达明显下降[(3.09±0.13) vs. (1.86+0.39)，P<0.01；(1.98±0.02)，P<0.01]，见图2，表4。表明Safingol和D609可阻断TNF-α对IP3R1蛋白表达的上调，进一步说明PC-PLC和PKC-α参与了系膜细胞中TNF-α促进IP3R1蛋白的表达。
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2.3 PKC-α活性检测
TNF-α处理0、4、8、24 h各组在阳极均可见特异性比较微弱的磷酸化条带；而TNF-α处理8 h磷酸化条带密度及宽度明显增强。说明TNF-α处理8 h，PKC-α的活化最强。而D609或Safingol预处理后，与8h组比较，PKC-α磷酸化条带明显减弱。表明D609 和Safingol可阻断TNF-α对PKC-α的活化。
3 讨论
IP3R是对第二信使IP3应答的一种普遍存在的胞内Ca2+释放通道，它在调节如受精、细胞收缩、增殖、神经信号传递等多种生物细胞功能活动中发挥重要作用。肾脏IP3R1主要存在于肾小球系膜细胞、血管平滑肌细胞[10] 。
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研究表明，胞内IP3R1表达增加，可能与房颤和哮喘及阿尔茨海默及帕金森氏病发病机制密切有关[5-7]；Wen等[11]和王静艳等[12]发现在肝硬化动物模型中，肾小球系膜细胞和入球小动脉平滑肌中IP3R1表达明显增加可能与肾脏低灌注有关[11-12]；而转化生长因子β下调IP3R1而降低GMCs和肾脏平滑肌的敏感性，与糖尿病肾脏低灌注进而发展成糖尿病肾病直接相关[13]。以上资料表明 IP3R数目和结构的变化可能会影响细胞内Ca2+信号的幅度和频率，将会导致细胞收缩功能紊乱。因此认为肾脏IP3R1表达的多少可能与肾脏对缩血管物质的敏感性有着密切联系，进而参与HRS发生与发展。
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