创伤弧菌脓毒症大鼠脑组织转位蛋白的表达及抗菌药物的干预(2)
【Key words】Vibro vulnificus； Sepsis encephalopathy； Translocator protein(TSPO)； Antibacterials； Rat
脓毒症脑病(septic encephalopathy，SE)是由脓毒症导致的急性、弥散性、可逆性脑损伤，是脓毒症最常见的并发症之一，近年来日益受到关注[1-2]。临床观察显示SE可显著增加脓毒症患者病死率，并影响ICU出院患者认知功能的恢复及生活质量，其发病机制尚不清楚[3]。目前认为，炎症损伤、缺血缺氧、线粒体功能障碍、细胞凋亡等机制在SE发病中占据重要地位[4]。转位蛋白18 kDa(translocator protein 18 kDa，TSPO)广泛分布于脑神经胶质细胞的线粒体外膜上，正常情况下表达水平低。当各种病因致使神经组织损伤和炎症反应时，随着神经胶质细胞聚集活化，TSPO的表达可迅速增高，参与局部炎症的调节与损伤的修复，是反映中枢神经系统损伤及神经胶质细胞活性的敏感指标[5]。SE发病时中枢神经系统TSPO的表达及变化至今尚不清楚。笔者推测TSPO可能参与SE的致病过程，TSPO水平可能是反映SE中枢神经系统的损伤的敏感指标。因此本研究构建创伤弧菌大鼠脓毒症模型，观察其脑组织中TSPO、促/抗炎症因子的表达及病理变化，并观察敏感抗菌药物干预的影响，现报道如下。
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1 材料与方法
1.1 实验动物 实验动物采用清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄各半，共100只，体质量为180～260 g，由温州医学院实验动物中心提供。
1.2 细菌来源 从创伤弧菌感染患者下肢血疱中抽取疱液，接种在血平板上，37 ℃、24 h培养分离纯化，细菌鉴定为创伤弧菌(细菌编号：705258)，按常规方法制作成创伤弧菌悬液，含菌量为6×108cfu/ml备用。
1.3 实验试剂Trizol试剂购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，PCR试剂盒购自Fermentas公司。RIPA裂解液(强)，BCA浓度测定试剂盒，彩色预染蛋白质分子量标准，辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，ECL试剂和显影定影试剂盒，均购自碧云天生物技术研究所；兔抗人PBR抗体购自Santa Cruz公司 和小鼠抗大鼠的β-actin抗体购自Abcam公司。免疫组化试剂盒由温州长风生物有限公司提供，头孢哌酮钠和左氧氟沙星注射液[分别由第一三供制药(北京)有限公司和中诺药业(石家庄)有限公司提供，批号分别为：0907E74、090403027]。TNF-α，IL-10，IL-6 ELISA试剂盒购自武汉博士德公司。
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1.4 实验方法
1.4.1构建大鼠创伤弧菌脓毒症脑损伤模型及实验分组 SD大鼠100只，雌雄各半，饲养1周，实验前禁食12 h，自由进水。随机(随机数字法)分组为4组，每组10只。A组(健康对照组，n=10)，麻醉后处死。B组(创伤弧菌脓毒症组，n=40)，予左后肢皮下注射创伤弧菌悬液，细菌含量为6×108 cfu/ml，剂量为0.1 ml/100 g，制作大鼠创伤弧菌脓毒症模型[6]；分别在染菌后6、12、24和48 h点麻醉后处死，各时相大鼠10只。C组(抗菌药物干预组，n=40)，感染创伤弧菌同B组，在染菌后4 h，给予左侧腹腔注射头孢哌酮钠180 mg/kg(12 h/次)，左氧氟沙星18 mg/kg(12 h/次)；分别在染菌后6、12、24和 48 h时间点麻醉后处死，各时相大鼠10只。D组(抗菌药物对照组，n=10)，予正常大鼠左侧腹腔注射头孢哌酮钠180 mg/kg(12 h/次)和左氧氟沙星18 mg/kg(12 h/次)，48 h麻醉处死。快速腹主动脉采血，常规方法制备血清， -70 ℃冰箱保存待用。麻醉后取鼠脑，无菌留取脑组织，部分新鲜组织分别浸泡在4%多聚甲醛溶液、2.5%戊二醛磷酸缓冲液中待做免疫组化及电镜，余下组织用4 ℃生理盐水冲洗后迅速置于液氮中保存待用。
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1.4.2 RT-PCR法检测大鼠脑组织TSPO表达 取冻存大鼠脑组织80～100 mg，Trizol试剂提取总RNA，以总RNA为模板，按RT试剂盒说明书逆转录成cDNA，然后以cDNA为模板，建立PCR反应体系，PCR反应程序为：变性94 ℃，30 s，退火67 ℃ ，30 s，延伸72 ℃，60 s，首次循环94 ℃预变性5 min，然后进行35个循环，最后72 ℃延伸5 min。引物序列及PCR条件见表1。扩增产物用1.6%琼脂糖凝胶电泳，同时和适量DNA ladder，电泳结果用凝胶成像系统成像，Gelpro32分析软件进行分析，以目的基因/RGOF为基因表达的相对值进行比较。
1.4.3 Western blotting检测大鼠脑组织TSPO蛋白含量 取脑组织约60 mg，按照RIPA裂解液说明书提取蛋白，采用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度，上样前加5×上样缓冲液，煮沸5 min，上样量10 μg。配制10%的分离胶和5%的浓缩胶(聚丙烯酰胺凝胶)，电泳时浓缩胶80 V，20 min，分离胶120 V，60 min；冰水浴中转膜320 mA，35 min，5%脱脂牛奶(光明乳业股份有限公司)室温下封闭90 min，兔抗TSPO抗体(1∶1000)和小鼠抗β-actin抗体(1∶10 000)4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体(1∶500)和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体(1∶1000)室温下孵育2 h，洗膜后ECL试剂盒显色，曝光成像，Quantity One分析软件进行分析，以目的蛋白/β-actin为蛋白表达相对值进行比较。
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脓毒症脑病(septic encephalopathy，SE)是由脓毒症导致的急性、弥散性、可逆性脑损伤，是脓毒症最常见的并发症之一，近年来日益受到关注[1-2]。临床观察显示SE可显著增加脓毒症患者病死率，并影响ICU出院患者认知功能的恢复及生活质量，其发病机制尚不清楚[3]。目前认为，炎症损伤、缺血缺氧、线粒体功能障碍、细胞凋亡等机制在SE发病中占据重要地位[4]。转位蛋白18 kDa(translocator protein 18 kDa，TSPO)广泛分布于脑神经胶质细胞的线粒体外膜上，正常情况下表达水平低。当各种病因致使神经组织损伤和炎症反应时，随着神经胶质细胞聚集活化，TSPO的表达可迅速增高，参与局部炎症的调节与损伤的修复，是反映中枢神经系统损伤及神经胶质细胞活性的敏感指标[5]。SE发病时中枢神经系统TSPO的表达及变化至今尚不清楚。笔者推测TSPO可能参与SE的致病过程，TSPO水平可能是反映SE中枢神经系统的损伤的敏感指标。因此本研究构建创伤弧菌大鼠脓毒症模型，观察其脑组织中TSPO、促/抗炎症因子的表达及病理变化，并观察敏感抗菌药物干预的影响，现报道如下。
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1.1 实验动物 实验动物采用清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄各半，共100只，体质量为180～260 g，由温州医学院实验动物中心提供。
1.2 细菌来源 从创伤弧菌感染患者下肢血疱中抽取疱液，接种在血平板上，37 ℃、24 h培养分离纯化，细菌鉴定为创伤弧菌(细菌编号：705258)，按常规方法制作成创伤弧菌悬液，含菌量为6×108cfu/ml备用。
1.3 实验试剂Trizol试剂购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，PCR试剂盒购自Fermentas公司。RIPA裂解液(强)，BCA浓度测定试剂盒，彩色预染蛋白质分子量标准，辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，ECL试剂和显影定影试剂盒，均购自碧云天生物技术研究所；兔抗人PBR抗体购自Santa Cruz公司 和小鼠抗大鼠的β-actin抗体购自Abcam公司。免疫组化试剂盒由温州长风生物有限公司提供，头孢哌酮钠和左氧氟沙星注射液[分别由第一三供制药(北京)有限公司和中诺药业(石家庄)有限公司提供，批号分别为：0907E74、090403027]。TNF-α，IL-10，IL-6 ELISA试剂盒购自武汉博士德公司。
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1.4.1构建大鼠创伤弧菌脓毒症脑损伤模型及实验分组 SD大鼠100只，雌雄各半，饲养1周，实验前禁食12 h，自由进水。随机(随机数字法)分组为4组，每组10只。A组(健康对照组，n=10)，麻醉后处死。B组(创伤弧菌脓毒症组，n=40)，予左后肢皮下注射创伤弧菌悬液，细菌含量为6×108 cfu/ml，剂量为0.1 ml/100 g，制作大鼠创伤弧菌脓毒症模型[6]；分别在染菌后6、12、24和48 h点麻醉后处死，各时相大鼠10只。C组(抗菌药物干预组，n=40)，感染创伤弧菌同B组，在染菌后4 h，给予左侧腹腔注射头孢哌酮钠180 mg/kg(12 h/次)，左氧氟沙星18 mg/kg(12 h/次)；分别在染菌后6、12、24和 48 h时间点麻醉后处死，各时相大鼠10只。D组(抗菌药物对照组，n=10)，予正常大鼠左侧腹腔注射头孢哌酮钠180 mg/kg(12 h/次)和左氧氟沙星18 mg/kg(12 h/次)，48 h麻醉处死。快速腹主动脉采血，常规方法制备血清， -70 ℃冰箱保存待用。麻醉后取鼠脑，无菌留取脑组织，部分新鲜组织分别浸泡在4%多聚甲醛溶液、2.5%戊二醛磷酸缓冲液中待做免疫组化及电镜，余下组织用4 ℃生理盐水冲洗后迅速置于液氮中保存待用。
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1.4.3 Western blotting检测大鼠脑组织TSPO蛋白含量 取脑组织约60 mg，按照RIPA裂解液说明书提取蛋白，采用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度，上样前加5×上样缓冲液，煮沸5 min，上样量10 μg。配制10%的分离胶和5%的浓缩胶(聚丙烯酰胺凝胶)，电泳时浓缩胶80 V，20 min，分离胶120 V，60 min；冰水浴中转膜320 mA，35 min，5%脱脂牛奶(光明乳业股份有限公司)室温下封闭90 min，兔抗TSPO抗体(1∶1000)和小鼠抗β-actin抗体(1∶10 000)4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体(1∶500)和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体(1∶1000)室温下孵育2 h，洗膜后ECL试剂盒显色，曝光成像，Quantity One分析软件进行分析，以目的蛋白/β-actin为蛋白表达相对值进行比较。
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