盐酸戊乙奎醚对大鼠呼吸机所致肺损伤的保护作用及其机制(1)
机械通气是抢救危重症患者的重要手段，更成为急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)治疗的革命性进步，但其本身亦可引发或加重肺损伤，即呼吸机所致肺损伤(ventilator-induced lung injury， VILI)[1-3]。研究发现，“晚期”炎症介质高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein， HMGB1)参与了VILI的发病过程[4]。盐酸戊乙奎醚(penehyclidine hydrochloride， PHC)是我国自主研发的新型选择性莨菪类药物，因对M胆碱受体的高选择性，心血管不良反应小，大大拓宽了其临床应用，除了用于抢救有机磷中毒和麻醉术前给药外，PHC还具有改善微循环、抑制炎症反应、降低毛细血管通透性等作用，被应用于ALI的治疗，但其对VILI的保护作用及其机制尚未见报道[5]。本研究通过复制VILI大鼠模型，观察不同剂量PHC对VILI大鼠肺组织的保护作用以及对HMGB1蛋白和mRNA表达的影响，并探讨其细胞信号调节机制。
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1 材料与方法
1.1 材料
健康清洁雄性SD大鼠40只，8～12周龄，体质量250～300 g，由南方医科大学实验动物中心提供。实验前分笼饲养2周，自由摄取食水。盐酸戊乙奎醚(长托宁，批号100302，成都力思特制药股份有限公司)，一抗试剂HMGB1、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、应激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)和p38 MAPK、磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)、p-JNK1/2、p-p38和二抗试剂辣根过氧化物酶标记物(美国Santa Cruz公司)，ECL化学发光试剂盒(美国Amersham公司)，Oligo(dT)12-18、M-mlV逆转录酶和Taq DNA聚合酶(美国Promega公司)，RNA提取试剂(德国Boehringer Mannhein公司)，髓过氧化物酶(MPO)试剂盒、考马斯亮蓝(南京建成生物工程研究所究)，PCR引物由上海生工生物工程公司合成。
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1.2 大鼠VILI模型复制与分组
40只SD大鼠随机(随机数字法)分为5组(n=8)，分别为对照组、机械通气组、机械通气+PHC 1.0 mg/kg、机械通气+PHC 0.5 mg/kg和机械通气+PHC 0.1 mg/kg组。麻醉大鼠，起效后行备皮、消毒，进行气管切开，将16G静脉穿刺留置导管插入气管以作气管导管用，接小动物呼吸机(型号683，美国Harvard Apparatus公司)行机械通气。机械通气参数设置为潮气量Vt=30 ml/kg、PEEP=0 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)、吸呼比1∶1，调节呼吸频率(RR)在40～70之间，使PETCO2维持在35～45 mm Hg，通气时间为4 h。右颈总动脉置管测定动脉压，左股静脉置管用于输液和给药。监测动物血压、心率和心电图在正常范围内，用气体检测仪(美国Datex公司)监测PETCO2。对照组动物除不行机械通气外，其余操作同机械通气组。到预定时间后，放血处死。
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1.3 观察指标与测定方法
1.3.1 肺组织病理学改变 右上叶肺组织用10 %甲醛固定，经石蜡包埋切片、苏木精-伊红染色后，光镜观察病理学改变。
1.3.2 肺组织湿/干质量比值(W/D) 取大鼠右肺中叶组织，称湿质量(W)后于干燥箱中80 ℃烤至恒质量并称干质量(D)，计算肺W/D比值。
1.3.3 支气管肺泡灌洗液(BALF)中WBC计数和总蛋白含量测定 左肺行肺灌洗，回收后800 r/min离心10 min，沉淀物用PBS稀释后行瑞氏染色，光镜下行白细胞计数。BALF中总蛋白的测定采用考马斯亮蓝染色法。
1.3.4 肺组织MPO活性测定 肺组织MPO活性测定采用MPO试剂盒。
1.3.5 HMGB1 mRNA表达的测定 按Trizol一步法提取总RNA，逆转录合成cDNA。取逆转录产物进行PCR反应(94 ℃变性1 min，54 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环)。HMGB1的扩增引物为：5’-ATG GGC AAA GGA GAT CCT A -3’和5’-ATT CAT CAT CAT CAT TCT TCT-3’；内对照GAPDH的扩增引物为：5’-CCC ATC ACC ATC TTC CAG GA-3’和5’-TGC TTC ACC ACC TTC TTG AT-3’。2 %琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像系统(美国Kodak公司)采集图像并进行半定量分析，以HMGB1/GAPDH灰度比值表示各组HMGB1 mRNA的水平，各组实验重复3次。
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1.3.6 HMGB1蛋白表达和MAPK活性的测定 肺组织加入细胞裂解液后冰上匀浆，蛋白质定量采用Bradford法，样品加入2×SDS加样缓冲液，行SDS-PAGE凝胶分离，蛋白条带半干电转移到PVDF膜上。室温下用TTBS(100 mmol/L Tris-HCl，0.9% NaCl，0.1% 吐温-20)阻断1 h，先后分别用HMGB1、ERK1/2、p38、JNK1/2、p-ERK1/2、p-p38、p-JNK1/2的一抗和辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，最后用增强化学发光法(ECL)检测阳性信号。采用凝胶成像分析系统进行半定量分析，以灰度比值表示各组HMGB1蛋白和MAPK磷酸化水平。
1.4 统计学方法
所得数据用均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS 13.0软件处理。采用单因素方差分析进行不同组别间的比较，方差齐者组间比较用LSD-t检验，方差不齐者用Tamhane’s T2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
, 百拇医药(丁宁 肖慧 许立新 佘守章)
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1.1 材料
健康清洁雄性SD大鼠40只，8～12周龄，体质量250～300 g，由南方医科大学实验动物中心提供。实验前分笼饲养2周，自由摄取食水。盐酸戊乙奎醚(长托宁，批号100302，成都力思特制药股份有限公司)，一抗试剂HMGB1、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、应激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)和p38 MAPK、磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)、p-JNK1/2、p-p38和二抗试剂辣根过氧化物酶标记物(美国Santa Cruz公司)，ECL化学发光试剂盒(美国Amersham公司)，Oligo(dT)12-18、M-mlV逆转录酶和Taq DNA聚合酶(美国Promega公司)，RNA提取试剂(德国Boehringer Mannhein公司)，髓过氧化物酶(MPO)试剂盒、考马斯亮蓝(南京建成生物工程研究所究)，PCR引物由上海生工生物工程公司合成。
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1.2 大鼠VILI模型复制与分组
40只SD大鼠随机(随机数字法)分为5组(n=8)，分别为对照组、机械通气组、机械通气+PHC 1.0 mg/kg、机械通气+PHC 0.5 mg/kg和机械通气+PHC 0.1 mg/kg组。麻醉大鼠，起效后行备皮、消毒，进行气管切开，将16G静脉穿刺留置导管插入气管以作气管导管用，接小动物呼吸机(型号683，美国Harvard Apparatus公司)行机械通气。机械通气参数设置为潮气量Vt=30 ml/kg、PEEP=0 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)、吸呼比1∶1，调节呼吸频率(RR)在40～70之间，使PETCO2维持在35～45 mm Hg，通气时间为4 h。右颈总动脉置管测定动脉压，左股静脉置管用于输液和给药。监测动物血压、心率和心电图在正常范围内，用气体检测仪(美国Datex公司)监测PETCO2。对照组动物除不行机械通气外，其余操作同机械通气组。到预定时间后，放血处死。
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1.3 观察指标与测定方法
1.3.1 肺组织病理学改变 右上叶肺组织用10 %甲醛固定，经石蜡包埋切片、苏木精-伊红染色后，光镜观察病理学改变。
1.3.2 肺组织湿/干质量比值(W/D) 取大鼠右肺中叶组织，称湿质量(W)后于干燥箱中80 ℃烤至恒质量并称干质量(D)，计算肺W/D比值。
1.3.3 支气管肺泡灌洗液(BALF)中WBC计数和总蛋白含量测定 左肺行肺灌洗，回收后800 r/min离心10 min，沉淀物用PBS稀释后行瑞氏染色，光镜下行白细胞计数。BALF中总蛋白的测定采用考马斯亮蓝染色法。
1.3.4 肺组织MPO活性测定 肺组织MPO活性测定采用MPO试剂盒。
1.3.5 HMGB1 mRNA表达的测定 按Trizol一步法提取总RNA，逆转录合成cDNA。取逆转录产物进行PCR反应(94 ℃变性1 min，54 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环)。HMGB1的扩增引物为：5’-ATG GGC AAA GGA GAT CCT A -3’和5’-ATT CAT CAT CAT CAT TCT TCT-3’；内对照GAPDH的扩增引物为：5’-CCC ATC ACC ATC TTC CAG GA-3’和5’-TGC TTC ACC ACC TTC TTG AT-3’。2 %琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像系统(美国Kodak公司)采集图像并进行半定量分析，以HMGB1/GAPDH灰度比值表示各组HMGB1 mRNA的水平，各组实验重复3次。
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1.3.6 HMGB1蛋白表达和MAPK活性的测定 肺组织加入细胞裂解液后冰上匀浆，蛋白质定量采用Bradford法，样品加入2×SDS加样缓冲液，行SDS-PAGE凝胶分离，蛋白条带半干电转移到PVDF膜上。室温下用TTBS(100 mmol/L Tris-HCl，0.9% NaCl，0.1% 吐温-20)阻断1 h，先后分别用HMGB1、ERK1/2、p38、JNK1/2、p-ERK1/2、p-p38、p-JNK1/2的一抗和辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，最后用增强化学发光法(ECL)检测阳性信号。采用凝胶成像分析系统进行半定量分析，以灰度比值表示各组HMGB1蛋白和MAPK磷酸化水平。
1.4 统计学方法
所得数据用均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS 13.0软件处理。采用单因素方差分析进行不同组别间的比较，方差齐者组间比较用LSD-t检验，方差不齐者用Tamhane’s T2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
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