不同方法移植骨髓干细胞对兔梗死心肌面积的影响(1)
急性心肌梗死的临床治疗方法有保守、溶栓、介入、冠脉搭桥、心脏移植等方法，前4种方法均不能使已坏死心肌得到修复，心脏移植虽能取代受损的心脏，但会面临供体来源、受体排斥、费用昂贵及伦理等问题，临床上很难推广。骨髓干细胞治疗移植途径主要为心外膜注射、心内膜注射、冠脉导管注射和静脉注射[1]。其中静脉注射是目前公认为最安全的一种干细胞治疗方法。骨髓干细胞具有向损伤部位归巢的特性，故可用于治疗急性心肌梗死[2-4]。本实验将使用心外膜及静脉移植法将自体骨髓干细胞移植急性心梗后心肌组织，观察自体骨髓干细胞在急性心梗模型中的生存分化情况，通过计算梗死面积比较两种方法的治疗效果。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康新西兰兔60只，月龄2～4个月，体质量2～3 kg，由大连医科大学动物实验中心提供。
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1.2 试剂
胎牛血清为德国PAA；低糖DEME培养基购自美国Hyclone公司；胰蛋白酶及小鼠单克隆抗体均购自澳洲GIBCO公司；Brdu试剂购自美国Sigma公司；淋巴细胞分离液购自中国天津新灏阳公司；二抗试剂盒购自中国中杉金桥公司。
1.3 实验方法
1.3.1 动物分组方法 60只新西兰大白兔随机(随机数字法)分为心外膜组(实验Ⅰ组)、耳缘静脉组(实验Ⅱ组)及对照组，每组各20只。实验I组于梗死区直接移植自体骨髓干细胞；实验Ⅱ组经耳缘静脉移植自体骨髓干细胞。
1.3.2 自体骨髓干细胞的制备 无菌条件下使用3%戊巴比妥钠，以1 mL/kg经耳缘静脉麻醉。应用1%利多卡因局部麻醉后，应用骨髓穿刺针接10 mL注射器内含1 mL的肝素钠和1 mL完全培养基，于新西兰兔膝关节胫骨平台处，穿入骨髓腔抽取约8 mL骨髓液，加入磷酸盐缓冲液(PBS)按1∶1稀释，按2∶1加入含有淋巴细胞分离液的离心管中， 应用高速离心机(Sigma，美国)3000 r/min，离心20 min。提取中层和底层之间云雾状的淋巴细胞层。提取后使用无血清的DMEM培养基清洗2遍，1000 r/min，离心10 min。应用完全培养基将沉淀完全吹打成细胞悬液。提取适量的细胞悬液，并稀释，加入1 mL 0.4%台盼蓝，鉴定细胞的活性。调整细胞数为105L-1，接种至25 cm2培养瓶中，注满完全培养基，放入体积分数为5%CO2饱和湿度，37 ℃细胞孵箱(HEPA Class 100，Thermo公司)中培养。
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1.3.3 骨髓干细胞培养及传代 骨髓干细胞培养5 d后，倒置显微镜下(OLYMPUS，日本)可见90%细胞趋向梭形均贴壁，进行全量换液，随后3 d换液一次。接种后2周左右细胞长至约90%融合，加入0.25%的胰酶+EDTA于37 ℃消化1～2 min，观察细胞逐渐变圆并脱落，加入完全培养基终止消化，加入平衡盐溶液(D-Hanks液)漂洗2次，吹打成细胞悬液，按1∶3传代接种为P1，以此类推得到P3。
1.3.4 急性心肌梗死模型的制备 3%戊巴比妥钠按1 mL/kg经耳缘静脉充分麻醉后，连接心电图，记录标准Ⅱ导联心电图，气管切开连接DW-2000型动物人工呼吸机(上海嘉鹏科技有限公司)。固定于手术台，常规备皮、消毒、铺无菌单。在胸骨左缘第2、3肋间开胸，用钝性器械撑开2、3肋骨，剪开心包膜，充分暴露心脏，结扎左冠状动脉前降支中部1/2处，观察心电图Ⅱ、Ⅲ导联出现ST段抬高大于0.2 mV，且持续超过30 min，左冠状动脉前降支供血区明显发绀，收缩减弱证明心梗模型制造成功。术后连续3 d应用青霉素肌肉注射预防感染。
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1.3.5 骨髓干细胞的标记及检测 P3融合至70%～80%时，制成细胞悬液，接种到培养皿中，(内放置一盖玻片)。换用Brdu浓度为10 μmol/L的完全培养基，培养48 h。取出细胞爬片，培养皿的细胞换液继续培养。取出细胞爬片PBS清洗。4%多聚甲醛固定，PBS清洗。加入2 mol/L HCL，室温放置，PBS清洗。加0.3%tritonx-100，PBS清洗。加入3%H2O2去离子水，PBS清洗。正常山羊血清封闭。加入一抗(1∶100)，4 ℃过夜。PBS清洗，加入生物素标记的二抗孵育，PBS清洗，并用甘油封片。使用免疫荧光显微镜(OLYMPUS，日本)，在200倍下，观察细胞核的标记程度。随意选取5个视野，计数阳性细胞(绿色荧光)与非阳性细胞。
1.3.6 骨髓干细胞的移植 在制成模型第二周时，将细胞制成细胞悬液。 对照组：开胸注射PBS缓释液30 μL。实验Ⅰ组：再次开胸，分别在心梗前后缘上中下各三点注射自体骨髓干细胞共30μL(5×106/100 μL)。实验Ⅱ组：自耳缘静脉注射自体骨髓干细胞30 μL(5×106/100 μL)。
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1.3.7 梗死面积的计算 移植干细胞4周后，取出心脏，计算梗死面积。先从外观计算梗死心肌梗死的面积，随后利用冰冻冷切机将心脏按照固定的厚度6 mm，进行不间断的完全切片，并进行HE染色：将切片固定于载玻片上，置于Harris苏木素液5 min，水洗1 min，75%盐酸乙醇分化30 s，水洗，氨水处理30 s，水洗1 min，酸化伊红乙醇液染12 min，自来水快速冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明后中性树胶封固。在显微镜下利用病理图像分析系统，进行梗死瘢痕的面积测量。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学处理。数据以中值和百分位数(上四分位数，下四分位数)表示。组间比较用秩和检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
细胞分离培养5 d后，镜下观察细胞均牢牢贴壁，且细胞融合度达到80%～90%。进行消化传代使细胞纯化(表1)。传代后细胞继续培养3 d，基本铺满瓶底，细胞间相互融合，呈梭形形状(图1)。细胞进行Brdu染色，通过鉴定，细胞阳性染色率为95%(图2)。心肌梗死后，注射骨髓干细胞4周后，心脏大体标本可见瘢痕形成，颜色呈暗灰色，与周围正常心肌区别明显，但边界模糊。心肌组织HE染色显示心肌梗死区心肌纤维排列紊乱，与正常心肌组织分界明显，心肌细胞消失或崩解，取而代之的为心肌纤维瘢痕(图3、4)。, 百拇医药(纪丽丽 龙晓凤 田辉 刘宇飞)
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康新西兰兔60只，月龄2～4个月，体质量2～3 kg，由大连医科大学动物实验中心提供。
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1.2 试剂
胎牛血清为德国PAA；低糖DEME培养基购自美国Hyclone公司；胰蛋白酶及小鼠单克隆抗体均购自澳洲GIBCO公司；Brdu试剂购自美国Sigma公司；淋巴细胞分离液购自中国天津新灏阳公司；二抗试剂盒购自中国中杉金桥公司。
1.3 实验方法
1.3.1 动物分组方法 60只新西兰大白兔随机(随机数字法)分为心外膜组(实验Ⅰ组)、耳缘静脉组(实验Ⅱ组)及对照组，每组各20只。实验I组于梗死区直接移植自体骨髓干细胞；实验Ⅱ组经耳缘静脉移植自体骨髓干细胞。
1.3.2 自体骨髓干细胞的制备 无菌条件下使用3%戊巴比妥钠，以1 mL/kg经耳缘静脉麻醉。应用1%利多卡因局部麻醉后，应用骨髓穿刺针接10 mL注射器内含1 mL的肝素钠和1 mL完全培养基，于新西兰兔膝关节胫骨平台处，穿入骨髓腔抽取约8 mL骨髓液，加入磷酸盐缓冲液(PBS)按1∶1稀释，按2∶1加入含有淋巴细胞分离液的离心管中， 应用高速离心机(Sigma，美国)3000 r/min，离心20 min。提取中层和底层之间云雾状的淋巴细胞层。提取后使用无血清的DMEM培养基清洗2遍，1000 r/min，离心10 min。应用完全培养基将沉淀完全吹打成细胞悬液。提取适量的细胞悬液，并稀释，加入1 mL 0.4%台盼蓝，鉴定细胞的活性。调整细胞数为105L-1，接种至25 cm2培养瓶中，注满完全培养基，放入体积分数为5%CO2饱和湿度，37 ℃细胞孵箱(HEPA Class 100，Thermo公司)中培养。
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1.3.3 骨髓干细胞培养及传代 骨髓干细胞培养5 d后，倒置显微镜下(OLYMPUS，日本)可见90%细胞趋向梭形均贴壁，进行全量换液，随后3 d换液一次。接种后2周左右细胞长至约90%融合，加入0.25%的胰酶+EDTA于37 ℃消化1～2 min，观察细胞逐渐变圆并脱落，加入完全培养基终止消化，加入平衡盐溶液(D-Hanks液)漂洗2次，吹打成细胞悬液，按1∶3传代接种为P1，以此类推得到P3。
1.3.4 急性心肌梗死模型的制备 3%戊巴比妥钠按1 mL/kg经耳缘静脉充分麻醉后，连接心电图，记录标准Ⅱ导联心电图，气管切开连接DW-2000型动物人工呼吸机(上海嘉鹏科技有限公司)。固定于手术台，常规备皮、消毒、铺无菌单。在胸骨左缘第2、3肋间开胸，用钝性器械撑开2、3肋骨，剪开心包膜，充分暴露心脏，结扎左冠状动脉前降支中部1/2处，观察心电图Ⅱ、Ⅲ导联出现ST段抬高大于0.2 mV，且持续超过30 min，左冠状动脉前降支供血区明显发绀，收缩减弱证明心梗模型制造成功。术后连续3 d应用青霉素肌肉注射预防感染。
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1.3.5 骨髓干细胞的标记及检测 P3融合至70%～80%时，制成细胞悬液，接种到培养皿中，(内放置一盖玻片)。换用Brdu浓度为10 μmol/L的完全培养基，培养48 h。取出细胞爬片，培养皿的细胞换液继续培养。取出细胞爬片PBS清洗。4%多聚甲醛固定，PBS清洗。加入2 mol/L HCL，室温放置，PBS清洗。加0.3%tritonx-100，PBS清洗。加入3%H2O2去离子水，PBS清洗。正常山羊血清封闭。加入一抗(1∶100)，4 ℃过夜。PBS清洗，加入生物素标记的二抗孵育，PBS清洗，并用甘油封片。使用免疫荧光显微镜(OLYMPUS，日本)，在200倍下，观察细胞核的标记程度。随意选取5个视野，计数阳性细胞(绿色荧光)与非阳性细胞。
1.3.6 骨髓干细胞的移植 在制成模型第二周时，将细胞制成细胞悬液。 对照组：开胸注射PBS缓释液30 μL。实验Ⅰ组：再次开胸，分别在心梗前后缘上中下各三点注射自体骨髓干细胞共30μL(5×106/100 μL)。实验Ⅱ组：自耳缘静脉注射自体骨髓干细胞30 μL(5×106/100 μL)。
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1.3.7 梗死面积的计算 移植干细胞4周后，取出心脏，计算梗死面积。先从外观计算梗死心肌梗死的面积，随后利用冰冻冷切机将心脏按照固定的厚度6 mm，进行不间断的完全切片，并进行HE染色：将切片固定于载玻片上，置于Harris苏木素液5 min，水洗1 min，75%盐酸乙醇分化30 s，水洗，氨水处理30 s，水洗1 min，酸化伊红乙醇液染12 min，自来水快速冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明后中性树胶封固。在显微镜下利用病理图像分析系统，进行梗死瘢痕的面积测量。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学处理。数据以中值和百分位数(上四分位数，下四分位数)表示。组间比较用秩和检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
细胞分离培养5 d后，镜下观察细胞均牢牢贴壁，且细胞融合度达到80%～90%。进行消化传代使细胞纯化(表1)。传代后细胞继续培养3 d，基本铺满瓶底，细胞间相互融合，呈梭形形状(图1)。细胞进行Brdu染色，通过鉴定，细胞阳性染色率为95%(图2)。心肌梗死后，注射骨髓干细胞4周后，心脏大体标本可见瘢痕形成，颜色呈暗灰色，与周围正常心肌区别明显，但边界模糊。心肌组织HE染色显示心肌梗死区心肌纤维排列紊乱，与正常心肌组织分界明显，心肌细胞消失或崩解，取而代之的为心肌纤维瘢痕(图3、4)。, 百拇医药(纪丽丽 龙晓凤 田辉 刘宇飞)