脑内乙酰胆碱与认知活动的关系(1)
摘要 脑内细胞外乙酰胆碱(ACh)的变化主要反映胆碱能神经元的活动，皮层和海马等脑区的ACh主要来源于基底前脑胆碱能神经元的纤维投射。应用微透析等技术在体检测清醒、自由活动动物认知过程中脑内乙酰胆碱的含量，可以研究ACh与特定行为反应和认知活动之间的关系。研究发现当机体需要对新刺激进行分析时，在学习与记忆、空间工作记忆、注意、自发运动和探究行为等认知活动中，基底前脑胆碱能神经元被激活，脑内ACh的释放也随之改变。结果提示脑内胆碱能递质系统活动与认知过程密切相关。
关键词 乙酰胆碱，学习与记忆，注意，自发活动量，探究行为。
分类号 B845
1 前言
乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)是中枢神经系统中第一个被测定其脑内含量的神经递质，脑内细胞外液中ACh的变化与中枢神经系统功能的改变有着密切的关系。Bulbring等(1941)首先检测了刺激外周神经引起的脊髓内ACh含量的变化，随后又有研究者陆续测定认知活动过程中皮层内ACh的改变，尤其是随着微透析等检测技术的发展，研究清醒、自由活动动物认知过程中的脑内ACh动态变化已经成为可能。结果发现当机体需要对新刺激(奖赏或惩罚)进行分析时，基底前脑胆碱能神经元被激活，皮层、海马等脑区内ACh的释放随着学习与记忆、注意、自发活动、探究行为等认知活动而发生改变。
, 百拇医药
脑内细胞外的ACh是由胆碱能神经末梢所释放，所以细胞外ACh的水平与胆碱能神经元的活动相一致。脑内主要的胆碱能系统是基底前脑至皮层和海马的胆碱能纤维投射。早期研究指出：刺激动物前爪、中脑网状结构和基底核以兴奋它们向皮层的投射，可同时引起感觉、运动皮层和顶叶皮层ACh释放；随后的一系列研究也证实大脑皮层处于激活状态时ACh的释放量大大高于基础状态。另一方面，应用电生理方法记录神经元的活动，发现ACh的释放量决定于神经轴突末梢内Ca2+浓度以及神经动作电位的频率；反之，利用微透析技术在灌流液中给予河豚毒阻断神经末梢的兴奋后，ACh的释放减少。以上实验均提示细胞外ACh的变化代表了胆碱能神经元的活动状态，而胆碱能系统向大脑皮层的兴奋投射是引起皮层兴奋的主要原因。
2 认知过程中脑内ACh的检测
静息状态下ACh储存在神经末梢的突触小泡内，当动作电位传导至神经末梢时释放到突触间隙，经扩散与突触前和突触后的M和N胆碱能受体结合，最后被胆碱酯酶水解。多数研究者采用生化、生物学和免疫组织化学方法测定脑组织匀浆中ACh的含量，但脑组织被匀浆后ACh损失很多，造成检测的灵敏度较低：而且为了阻止ACh的分解，需用微波辐射法处死动物以迅速灭活代谢酶。为了研究认知活动过程中脑内ACh含量的动态变化，杯形技术(Cup Technique)和微透析技术(MierodialysisTechnique)先后得到广泛应用，尤其是针对清醒、自由活动动物认知活动的研究。
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杯形技术：通过在脑膜上轻微施压后得到的液体柱来探测脑内神经递质的含量，杯内需填充含有胆碱酯酶抑制剂的溶液以防止ACh分解，否则无法检测。利用可以将cup植入到皮层的优点，Beani等(1968)首次在清醒、自由活动动物上测定ACh含量，而不仅仅是麻醉动物，发现动物行为反应的减少和脑电图的抑制均与ACh的释放减少有密切关系；反之，当动物活动增加时，伴有ACh释放的增加。Casamenti等的研究是在产生吗啡依赖的自由活动大鼠上进行的，发现吗啡耐受时皮层ACh没有变化，而纳洛酮诱发戒断时ACh含量明显增加。杯形技术的缺点一是样本收集困难和收集时间长，造成检测的灵敏度较低；二是cup只能放置在皮层表面，只能研究皮层ACh的变化，不能检测其它深部脑区ACh的含量。因此杯形技术不能研究较复杂的行为改变时脑内ACh的变化。
微透析技术：Delgado等(1972)首先提出了组织透析取样技术(Dialytrode)，后由Ungerstedt(1974)将其进一步发展，并首次报道用于自由活动动物的在体研究中。其基本原理是在透析作用下，细胞外神经递质水平与透析液中含量相一致。微透析技术不需要在透析液中加入胆碱酯酶抑制剂，尽管胆碱酯酶是高效的，但还是可以检测到细胞外液中ACh的含量。Scali等(1997)测得在平静状态下成年大鼠大脑皮层和海马透析液中ACh的含量分别是5.5±1.0和5.0±1.0 fmole/μL。为了减少样本收集时间和减少ACh的分解，也可在透析液中加入胆碱酯酶抑制剂，如果加入7μM毒扁豆碱，则皮层ACh的含量是54.5±59.2 fmole/μL。目前微透析技术已成为检测认知过程中神经递质含量的主要方法。微透析采集的样品量微、体积小，与高效液相色谱分析(High performance liquid chromatography，HPLC)结合起来能够探测细胞外各种神经递质的含量，包括ACh、胺类、腺苷、NO、多肽、氨基酸和其它内源性分子。它的优点在于不仅可以检测皮层ACh含量，还可以检测皮层下深部结构的ACh水平。
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3 ACh与学习记忆
3.1 损毁胆碱能通路导致学习记忆损伤
基底前脑向皮层和海马的胆碱能纤维投射是脑内最主要的胆碱能通路。早期的研究多采用机械、药物和电损毁的方法阻断基底前脑胆碱能神经元的投射，发现损毁后随着ACh释放的减少，也可诱发记忆的损伤。Flicker(1983)和Rawlms(1982)损毁隔-海马投射导致短时记忆时目标选择的精确性和T迷宫中操作能力的降低。Casamenti(1998)的实验则选择性损毁基底核，导致皮层ACh的释放持续降低，同时伴有被动回避反应和工作记忆的降低。Kasa(1997)的实验对胆碱能系统的损毁比较完全，当广泛损毁基底前脑向皮层和海马的投射后，导致认知功能的总体水平下降甚至痴呆。因此认为脑内胆碱能系统在认知功能尤其是记忆中发挥着重要作用。近期Winters和Bussey(2005)的研究也支持上述观点。
神经免疫毒素192-IgG-Saporin可以特异性损伤核团内的胆碱能神经元，但对非胆碱能神经元没有影响。因此，利用脑内注射192-IgG-Saporin的方法，可比前述方法更具有针对性地观察脑内胆碱能系统的功能。侧脑室注射192-IgG-Saporin的行为学研究显示：只有损毁>90%的胆碱能神经元后才可以产生比较可靠的行为学损伤，包括水迷宫任务的获得、延迟匹配任务、物体辨别获得等方面的损伤。Cahill和Baxter(2001)在基底前脑注射192-IgG-Saporin，阻断向皮层和海马的胆碱能投射，可导致皮层和海马ACh释放显著降低，并引起学习能力和策略选择, 百拇医药(于 萍 渠春环 李新旺 郭春彦)
关键词 乙酰胆碱，学习与记忆，注意，自发活动量，探究行为。
分类号 B845
1 前言
乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)是中枢神经系统中第一个被测定其脑内含量的神经递质，脑内细胞外液中ACh的变化与中枢神经系统功能的改变有着密切的关系。Bulbring等(1941)首先检测了刺激外周神经引起的脊髓内ACh含量的变化，随后又有研究者陆续测定认知活动过程中皮层内ACh的改变，尤其是随着微透析等检测技术的发展，研究清醒、自由活动动物认知过程中的脑内ACh动态变化已经成为可能。结果发现当机体需要对新刺激(奖赏或惩罚)进行分析时，基底前脑胆碱能神经元被激活，皮层、海马等脑区内ACh的释放随着学习与记忆、注意、自发活动、探究行为等认知活动而发生改变。
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脑内细胞外的ACh是由胆碱能神经末梢所释放，所以细胞外ACh的水平与胆碱能神经元的活动相一致。脑内主要的胆碱能系统是基底前脑至皮层和海马的胆碱能纤维投射。早期研究指出：刺激动物前爪、中脑网状结构和基底核以兴奋它们向皮层的投射，可同时引起感觉、运动皮层和顶叶皮层ACh释放；随后的一系列研究也证实大脑皮层处于激活状态时ACh的释放量大大高于基础状态。另一方面，应用电生理方法记录神经元的活动，发现ACh的释放量决定于神经轴突末梢内Ca2+浓度以及神经动作电位的频率；反之，利用微透析技术在灌流液中给予河豚毒阻断神经末梢的兴奋后，ACh的释放减少。以上实验均提示细胞外ACh的变化代表了胆碱能神经元的活动状态，而胆碱能系统向大脑皮层的兴奋投射是引起皮层兴奋的主要原因。
2 认知过程中脑内ACh的检测
静息状态下ACh储存在神经末梢的突触小泡内，当动作电位传导至神经末梢时释放到突触间隙，经扩散与突触前和突触后的M和N胆碱能受体结合，最后被胆碱酯酶水解。多数研究者采用生化、生物学和免疫组织化学方法测定脑组织匀浆中ACh的含量，但脑组织被匀浆后ACh损失很多，造成检测的灵敏度较低：而且为了阻止ACh的分解，需用微波辐射法处死动物以迅速灭活代谢酶。为了研究认知活动过程中脑内ACh含量的动态变化，杯形技术(Cup Technique)和微透析技术(MierodialysisTechnique)先后得到广泛应用，尤其是针对清醒、自由活动动物认知活动的研究。
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杯形技术：通过在脑膜上轻微施压后得到的液体柱来探测脑内神经递质的含量，杯内需填充含有胆碱酯酶抑制剂的溶液以防止ACh分解，否则无法检测。利用可以将cup植入到皮层的优点，Beani等(1968)首次在清醒、自由活动动物上测定ACh含量，而不仅仅是麻醉动物，发现动物行为反应的减少和脑电图的抑制均与ACh的释放减少有密切关系；反之，当动物活动增加时，伴有ACh释放的增加。Casamenti等的研究是在产生吗啡依赖的自由活动大鼠上进行的，发现吗啡耐受时皮层ACh没有变化，而纳洛酮诱发戒断时ACh含量明显增加。杯形技术的缺点一是样本收集困难和收集时间长，造成检测的灵敏度较低；二是cup只能放置在皮层表面，只能研究皮层ACh的变化，不能检测其它深部脑区ACh的含量。因此杯形技术不能研究较复杂的行为改变时脑内ACh的变化。
微透析技术：Delgado等(1972)首先提出了组织透析取样技术(Dialytrode)，后由Ungerstedt(1974)将其进一步发展，并首次报道用于自由活动动物的在体研究中。其基本原理是在透析作用下，细胞外神经递质水平与透析液中含量相一致。微透析技术不需要在透析液中加入胆碱酯酶抑制剂，尽管胆碱酯酶是高效的，但还是可以检测到细胞外液中ACh的含量。Scali等(1997)测得在平静状态下成年大鼠大脑皮层和海马透析液中ACh的含量分别是5.5±1.0和5.0±1.0 fmole/μL。为了减少样本收集时间和减少ACh的分解，也可在透析液中加入胆碱酯酶抑制剂，如果加入7μM毒扁豆碱，则皮层ACh的含量是54.5±59.2 fmole/μL。目前微透析技术已成为检测认知过程中神经递质含量的主要方法。微透析采集的样品量微、体积小，与高效液相色谱分析(High performance liquid chromatography，HPLC)结合起来能够探测细胞外各种神经递质的含量，包括ACh、胺类、腺苷、NO、多肽、氨基酸和其它内源性分子。它的优点在于不仅可以检测皮层ACh含量，还可以检测皮层下深部结构的ACh水平。
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3 ACh与学习记忆
3.1 损毁胆碱能通路导致学习记忆损伤
基底前脑向皮层和海马的胆碱能纤维投射是脑内最主要的胆碱能通路。早期的研究多采用机械、药物和电损毁的方法阻断基底前脑胆碱能神经元的投射，发现损毁后随着ACh释放的减少，也可诱发记忆的损伤。Flicker(1983)和Rawlms(1982)损毁隔-海马投射导致短时记忆时目标选择的精确性和T迷宫中操作能力的降低。Casamenti(1998)的实验则选择性损毁基底核，导致皮层ACh的释放持续降低，同时伴有被动回避反应和工作记忆的降低。Kasa(1997)的实验对胆碱能系统的损毁比较完全，当广泛损毁基底前脑向皮层和海马的投射后，导致认知功能的总体水平下降甚至痴呆。因此认为脑内胆碱能系统在认知功能尤其是记忆中发挥着重要作用。近期Winters和Bussey(2005)的研究也支持上述观点。
神经免疫毒素192-IgG-Saporin可以特异性损伤核团内的胆碱能神经元，但对非胆碱能神经元没有影响。因此，利用脑内注射192-IgG-Saporin的方法，可比前述方法更具有针对性地观察脑内胆碱能系统的功能。侧脑室注射192-IgG-Saporin的行为学研究显示：只有损毁>90%的胆碱能神经元后才可以产生比较可靠的行为学损伤，包括水迷宫任务的获得、延迟匹配任务、物体辨别获得等方面的损伤。Cahill和Baxter(2001)在基底前脑注射192-IgG-Saporin，阻断向皮层和海马的胆碱能投射，可导致皮层和海马ACh释放显著降低，并引起学习能力和策略选择, 百拇医药(于 萍 渠春环 李新旺 郭春彦)