心力衰竭病人β受体信号相关通路改变(1)
【摘要】目的:探讨心衰病人心肌组织β1、β2、β3受体mRNA表达的变化及其与相关信号通路的关系。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)方法检测24例瓣膜置换术的心衰病人和5例健康对照者心肌组织β1、β2、β3受体mRNA表达。用化学法和放免法测定心肌一氧化氮合酶(NOS)、诱导型NOS(iNOS)、环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)的变化。结果:心衰时心肌β3受体mRNA表达下调、cAMP生成减少;β1受体上调、NOS活性增加和cGMP生成增多,β1受体下调和β3受体上调均与心衰严重程度有关,β2受体表达无改变。结论:心衰时心脏β受体信号通路中包括β受体mRNA、cAMP、cGMP、NOS等多个环节发生改变,且改变程度与心功能相关。
关键词:心力衰竭;心肌;β肾上腺素受体;信号通路
中图分类号:R692.3 文喊标识码: A 文献编号:1671-4954(2010)04-242-05
doi:10.3969/j.issn.1671-4954.2010.04.004
肾上腺素能受体(β受体)-鸟苷酸调节蛋白(G蛋白)-腺苷酸环化酶(AC)系统是心肌受体信息的传递系统,对心肌的变力和变时的调控具有重要作用。目前已知心脏存在的β1、β2 、β3,三种β受体都通过与 G蛋白偶联而发挥作用。β受体经过G蛋白与AC偶联,形成复合体,此为交感跨膜信号传递途径的分子结构基础。
业已确认,β受体信号转导系统的改变对心衰的发生和发展以及临床治疗均有重要的意义。本文通过检测心衰患者心肌组织β受体mRNA表达及相关信号通路如NOS、iNOS、cAMP和cGMP的变化及其相关性来研究β受体信号通路与心衰的关系。
1资料与方法
1.1 研究对象
1.1.1因瓣膜性心脏病接受瓣膜置换术的心衰病人24例,男10例,女14例,年龄46.25+12.64岁;心功能Ⅱ级6例,Ⅲ级13例,Ⅳ级5例。
1.1.2正常对照组5例,来自意外伤亡的器官捐献者。
1.2 研究方法
1.2.1 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测心肌组织β1、β2、β3受体受体表达。
1.2.1.1 标本收集二尖瓣置换术的心衰病人手术中取黄豆大小左室乳头肌数块,意外伤亡者于死亡后立即取出心肌标本冷藏,4小时内取左室乳头肌数块,立即置入液氮中冷冻保存用于RT-PCR检测。
1.2.1.2 总RNA提取心肌组织50mg放人加有 l mlTrizol(上海生工)分离液的1.5ml EP管中,按说明书操作步骤提取总RNA,RNA样品纯度用OD260/OD280来衡量,本实验RNA样品的OD260/OD280在1.992～2.032之间,符合RNA样品纯度的要求。
1.2.1.3逆转录(RT)反应取总RNA21～μl(5μg)加 随机引物oligo(dT)21μl,70℃水浴变性5min后,冰 浴5min,依次加入下列试剂:dNTP2.5μl、5xbuffer4μl、RN A酶抑制剂1μl、AMV逆转录酶(Promege公司)3μl、DEPC处理的灭菌水5.5μl。混匀,置42℃反应60min,逆转录结束后,取出反应管于95℃变性5min,4℃10min,再保存于-20℃备PCR扩增反应用。
1.2.1.4聚合酶链反应 (PCR)建立50μl的扩增反应体系,依次加入下列试剂 :cDNA6μl、10xbuffer 4.5μl、lO mM dNTPs 1μl、上游引物(0.25μmoll/L)1μl 、下游引物 (0.25μmol/L)1μl、Taq DNA聚合酶lμl、DEPC处理水35.5μl。混匀后置 PCR仪,扩增条件如下:94℃预变性3min,94℃变性45s,退火(温度见表1)45s,72℃延伸1min,共循环35次;最后在72℃延伸10min,取出反应管置4℃10min,即可进行电泳。β-actin基因不受疾病及药物等因素的影响,表达稳定,选用β-actin基因为内对照,以消除上样等因素造成的误差。引物由广东心血管病研究所余细勇教授惠赠,dNTPs、Taq DNA聚合酶购自上海生工。(见表1)
1.2.1.5 RT-PCR产物电泳分析 制1.5%琼脂糖凝胶加入溴化乙锭,RT-PCR产物及 Marker各10μl分别上样电泳停止后,凝胶成像系统(美国AlphaInnotech公司chemilmager 5500型)分析处理,计算β受体mRNA与β-actin mRNA的灰度比值。
1.2.2放免法测定心肌组织环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)含量。
1.2.2.1 心肌组织处理 取组织50mg左右放入盛有2ml冷的50mM醋酸缓冲液的pH4.75试管内(放人冰浴),用匀浆器将组织粉碎后的悬浮液人10ml试管内,用2ml 无水乙醇洗匀浆器然后将乙醇倒入悬浮液内混匀静置5min,3000rpm离心15min,将上清液收集在青霉素小瓶内,再用75%乙醇lml洗匀浆器连续两次,用该2ml75%乙醇洗沉淀混匀3500rpm离心15min,合并上清液6O℃水浴中吹干。
单位:pmol/mg。
1.2.2.2试剂盒购自上海中医药大学同位素室,按说明书操作。
1.2.3化学法测定心肌组织一氧化氮合酶(NOS)和诱导型iNOS测定。
1.2.3.1心肌组织匀浆制备取心肌组织约0.15g加9倍的生理盐水1.35ml制备成10%的组织匀浆,3000rpm离心10min,取上清50μl测定 NOS活力,另取50μl测蛋白含量。
1.2.3.2蛋白含量测定方法 用紫外光谱吸收法测定蛋白含量,紫外分光光度计(UV2201型)测得样品A约在1.7～1.9范围内,表明样品是相对纯化、无核酸污染的蛋白溶液。用以下经验公式估算出蛋白质含量:蛋白质浓度(mg/m1)=1.45×A280mm-0.74×A260mm。
1.2.3.3 试剂盒购自南京建成生物工程公司,按说明书操作。
1.3 统计学处理
数据以均数±标准差(χ±s)表示,组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,采用SPSS 11.0软件包进行统计。
2 结果
2.1 RT～PCR法检测心肌组织β受体 mRNA表达结果 (表2)
心衰病人β1受体mRNA表达减少,其减少程度与心衰严重程度相关(图1);心衰病人β2受体mRNA有表达,不同程度心衰病人之间改变无显著性差异(图2);心衰病人β3,受体 mRNA表达增多,心衰程度越重表达越多 (图3)。
2.2
心肌组织NOS和iNOS的变化心衰病人心肌组织NOS、iNOS较正常人明显增高(P<0.01),心衰程度越重,其含量越多(表3)。
2.3
心肌组织cAMP和cGMP的变化心衰病人心肌组织中cAMP明显降低(P<0.01)随心衰加重其含量越少;而心肌组织cGMP含量明显增高 (P<0.01),心衰程度越重,其含量越多 (表4)
2.4 β受体mRNA表达量与相关信号通路的相关性
相关分析表明:心肌组织β1受体mRNA表达与心肌cAMP呈正相关,而与NOS、iNOS、和cGMP呈负相关(P<0.01);β2受体 mRNA表达与心肌中含量无相关性;而β3受体mRNA与心肌cGMP呈负相关,和心肌中NOS、iNOS、和cGMP呈正相关(P<0.01)(表5)。, http://www.100md.com
关键词:心力衰竭;心肌;β肾上腺素受体;信号通路
中图分类号:R692.3 文喊标识码: A 文献编号:1671-4954(2010)04-242-05
doi:10.3969/j.issn.1671-4954.2010.04.004
肾上腺素能受体(β受体)-鸟苷酸调节蛋白(G蛋白)-腺苷酸环化酶(AC)系统是心肌受体信息的传递系统,对心肌的变力和变时的调控具有重要作用。目前已知心脏存在的β1、β2 、β3,三种β受体都通过与 G蛋白偶联而发挥作用。β受体经过G蛋白与AC偶联,形成复合体,此为交感跨膜信号传递途径的分子结构基础。
业已确认,β受体信号转导系统的改变对心衰的发生和发展以及临床治疗均有重要的意义。本文通过检测心衰患者心肌组织β受体mRNA表达及相关信号通路如NOS、iNOS、cAMP和cGMP的变化及其相关性来研究β受体信号通路与心衰的关系。
1资料与方法
1.1 研究对象
1.1.1因瓣膜性心脏病接受瓣膜置换术的心衰病人24例,男10例,女14例,年龄46.25+12.64岁;心功能Ⅱ级6例,Ⅲ级13例,Ⅳ级5例。
1.1.2正常对照组5例,来自意外伤亡的器官捐献者。
1.2 研究方法
1.2.1 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测心肌组织β1、β2、β3受体受体表达。
1.2.1.1 标本收集二尖瓣置换术的心衰病人手术中取黄豆大小左室乳头肌数块,意外伤亡者于死亡后立即取出心肌标本冷藏,4小时内取左室乳头肌数块,立即置入液氮中冷冻保存用于RT-PCR检测。
1.2.1.2 总RNA提取心肌组织50mg放人加有 l mlTrizol(上海生工)分离液的1.5ml EP管中,按说明书操作步骤提取总RNA,RNA样品纯度用OD260/OD280来衡量,本实验RNA样品的OD260/OD280在1.992～2.032之间,符合RNA样品纯度的要求。
1.2.1.3逆转录(RT)反应取总RNA21～μl(5μg)加 随机引物oligo(dT)21μl,70℃水浴变性5min后,冰 浴5min,依次加入下列试剂:dNTP2.5μl、5xbuffer4μl、RN A酶抑制剂1μl、AMV逆转录酶(Promege公司)3μl、DEPC处理的灭菌水5.5μl。混匀,置42℃反应60min,逆转录结束后,取出反应管于95℃变性5min,4℃10min,再保存于-20℃备PCR扩增反应用。
1.2.1.4聚合酶链反应 (PCR)建立50μl的扩增反应体系,依次加入下列试剂 :cDNA6μl、10xbuffer 4.5μl、lO mM dNTPs 1μl、上游引物(0.25μmoll/L)1μl 、下游引物 (0.25μmol/L)1μl、Taq DNA聚合酶lμl、DEPC处理水35.5μl。混匀后置 PCR仪,扩增条件如下:94℃预变性3min,94℃变性45s,退火(温度见表1)45s,72℃延伸1min,共循环35次;最后在72℃延伸10min,取出反应管置4℃10min,即可进行电泳。β-actin基因不受疾病及药物等因素的影响,表达稳定,选用β-actin基因为内对照,以消除上样等因素造成的误差。引物由广东心血管病研究所余细勇教授惠赠,dNTPs、Taq DNA聚合酶购自上海生工。(见表1)
1.2.1.5 RT-PCR产物电泳分析 制1.5%琼脂糖凝胶加入溴化乙锭,RT-PCR产物及 Marker各10μl分别上样电泳停止后,凝胶成像系统(美国AlphaInnotech公司chemilmager 5500型)分析处理,计算β受体mRNA与β-actin mRNA的灰度比值。
1.2.2放免法测定心肌组织环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)含量。
1.2.2.1 心肌组织处理 取组织50mg左右放入盛有2ml冷的50mM醋酸缓冲液的pH4.75试管内(放人冰浴),用匀浆器将组织粉碎后的悬浮液人10ml试管内,用2ml 无水乙醇洗匀浆器然后将乙醇倒入悬浮液内混匀静置5min,3000rpm离心15min,将上清液收集在青霉素小瓶内,再用75%乙醇lml洗匀浆器连续两次,用该2ml75%乙醇洗沉淀混匀3500rpm离心15min,合并上清液6O℃水浴中吹干。
单位:pmol/mg。
1.2.2.2试剂盒购自上海中医药大学同位素室,按说明书操作。
1.2.3化学法测定心肌组织一氧化氮合酶(NOS)和诱导型iNOS测定。
1.2.3.1心肌组织匀浆制备取心肌组织约0.15g加9倍的生理盐水1.35ml制备成10%的组织匀浆,3000rpm离心10min,取上清50μl测定 NOS活力,另取50μl测蛋白含量。
1.2.3.2蛋白含量测定方法 用紫外光谱吸收法测定蛋白含量,紫外分光光度计(UV2201型)测得样品A约在1.7～1.9范围内,表明样品是相对纯化、无核酸污染的蛋白溶液。用以下经验公式估算出蛋白质含量:蛋白质浓度(mg/m1)=1.45×A280mm-0.74×A260mm。
1.2.3.3 试剂盒购自南京建成生物工程公司,按说明书操作。
1.3 统计学处理
数据以均数±标准差(χ±s)表示,组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,采用SPSS 11.0软件包进行统计。
2 结果
2.1 RT～PCR法检测心肌组织β受体 mRNA表达结果 (表2)
心衰病人β1受体mRNA表达减少,其减少程度与心衰严重程度相关(图1);心衰病人β2受体mRNA有表达,不同程度心衰病人之间改变无显著性差异(图2);心衰病人β3,受体 mRNA表达增多,心衰程度越重表达越多 (图3)。
2.2
心肌组织NOS和iNOS的变化心衰病人心肌组织NOS、iNOS较正常人明显增高(P<0.01),心衰程度越重,其含量越多(表3)。
2.3
心肌组织cAMP和cGMP的变化心衰病人心肌组织中cAMP明显降低(P<0.01)随心衰加重其含量越少;而心肌组织cGMP含量明显增高 (P<0.01),心衰程度越重,其含量越多 (表4)
2.4 β受体mRNA表达量与相关信号通路的相关性
相关分析表明:心肌组织β1受体mRNA表达与心肌cAMP呈正相关,而与NOS、iNOS、和cGMP呈负相关(P<0.01);β2受体 mRNA表达与心肌中含量无相关性;而β3受体mRNA与心肌cGMP呈负相关,和心肌中NOS、iNOS、和cGMP呈正相关(P<0.01)(表5)。, http://www.100md.com