人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建
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关键词 人端粒酶逆转录酶；原核表达载体；重组质粒
中图分类号 Q782
摘要 目的：构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T—1—hTERT，并观察融合蛋白的表达。方法：用RT—PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRI酶切位点的hTERT基因片段，与pGEM—T Easy连接，转化感受态大肠杆菌JMl09，经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落，用EcoR I酶切获取目的片段，并与EcoR I酶切过的pGEX—4T-1质粒连接，重组子转化BL21感受态大肠杆菌，PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2.0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T—1融合蛋白表达，用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定，薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果：PCR扩增等方法证实，人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T—1—hTERT构建成功，其中hTERT基因片段与GenBank：中相应基因同源性为98.73%，氨基酸序列同源性为99.68%。Western blot检出GST—hTERT融合蛋白，其表达量达28.4%。结论：成功构建了pGEX4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。
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