荧光定量ＰＣＲ在丙型肝炎病毒感染检测中的应用
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[摘要]目的 观察荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染检测中的临床应用情况。 方法 用FQ.PCR检测315份怀疑HCV感染的临床血清标本，并同时采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测抗HCV，用生化仪测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平，了解样本中HCV.RNA含量与抗HCV及ALT的相关性。 结果 315份标本中有225份HCV.RNA含量高于80拷贝·ml -1 ，250份抗HCV阳性，145例ALT异常，HCV.RNA含量与抗HCV阳性率间有显著的相关性(r=0.682，P=0.002);HCV.RNA含量与ALT异常率间也有显著的相关性(r=0.923，P=0.032)。 结论 FQ.PCR技术检测HCV.RNA特异性强，灵敏度高，具有良好的临床应用价值。
[关键词] 丙型肝炎病毒;聚合酶链反应;荧光定量
Clinicial significance of detection of HCV infection with FQ.PCR
YUHui ，YU Li-qin ，CHEN Chun-hui
(Department of Microbiology，Jiujiang Medical College，Jiujiang University，Jiujiang332000，China;Department of Lab，Jiujiang Third Hospital，Jiujiang332000，China)
Abstract:Objective To investigate the clinical application of the fluorescence quantitative PCR(FQ.PCR)in the detection of hepatitis C virus(HCV)infection.Methods Three hundred and fifteen sera from patients clinically diagnosed hepatitis C were detected by FQ.PCR，antibody to HCV were detected with ELISA，and alanine transferase(ALT)were detected by biolchemical instruments.Spearman correlation analysis was used to confirm the correlation between the HCV.RNA copies and the anti.HCV titers and ALT standard.Results HCV.RNA copies in225of315samples were more than80copies·ml -1 ，while250of315samples were detected anti.HCV positive，and145of315were detected abnomal at ALT.There were good correlation both between HCV.RNA copies and anti.HCV positive rate(r=0.682，P=0.002)，and between HCV.RNA copies and ALT abnormal rate(r=0.923，P=0.032).Conclusion FQ.PCR is a specific and sensitive method for the detection of HCV infection.It can be widely used in clinical detection.
Key words:hepatitis C virus;polymerase chain reaction;fluorescence quantitative
近年的许多研究表明，应用荧光定量聚合酶链反应(FQ.PCR)技术检测丙型肝炎病毒(HCV)RNA具有快速、特异、灵敏度高等优点。此方法的准确性对于丙型肝炎患者的早期诊断、治疗期间抗病毒药物的疗效评价、感染人群的普查以及污染源的监测均具有较高的使用价值。本实验用逆转录PCR结合荧光探针的体外RNA扩增技术对315例怀疑丙型肝炎的临床血清标本进行检测，从方法学的角度探讨此技术的临床应用价值。
1 资料和方法
1.1 标本来源
选取临床上疑为丙型肝炎的血清标本315份，其中312份乙型肝炎表面抗原(HbsAg)阴性，315份均为甲型肝炎抗体(抗HAV.IgM)和戊型肝炎抗体(抗.HEV.IgM和IgG)阴性，有3份HbsAg阳性，245份有输血史或注射史。
1.2 FQ.PCR检测方法
取50μl血清离心沉淀，提取RNA，逆转录后吸取5μl产物按常规方法进行PCR扩增，PCR反应后再经荧光检测仪测定荧光强度。具体的操作步聚，阴、阳性结果判断按说明书进行。试剂由中山大学达安基因诊断中心提供，用PE5700基因检测系统进行PCR扩增及数据处理。HCV.RNA在人体内的检测下限为80拷贝·ml -1 。每份血清同时采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测抗HCV，检测试剂由上海科华生物工程公司提供。用全自动生化仪测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平，正常值为<35U·L -1 。
1.3 统计学方法
HCV.RNA与抗HCV阳性率及ALT异常率的关系采用直线相关分析，所有的统计分析均利用SPSS10.0统计软件来完成。
2 结果
2.1 HCV.RNA及抗HCV检测结果
315份标本经FQ.PCR定量检测，有255份HCV.RNA含量高于80拷贝·ml -1 ，见表1。
表1 315份标本HCV.RNA及抗HCV(+)检测结果(略)
从表1可以看出，255份HCV.RNA含量高于80拷贝·ml -1 的病例中250例抗HCV阳性，经检验两者具有很好的相关性(r=0.682，P=0.002)。而低于80拷贝·ml -1 的病例有70%抗HCV阳性，这可能是由于部分病例经过药物治疗，使血中HCV.RNA水平处于低复制或无复制状态所致。
2.2 HCV.RNA含量与ALT异常的关系
255份HCV.RNA含量高于80拷贝·ml -1 的病例中，有125份ALT异常，其异常率随HCV.RNA含量的升高而增加，经统计学分析，ALT水平和HCV.RNA含量之间无相关性(经秩和检验，P=0.36)，而ALT异常率与HCV.RNA含量呈正相关(r=0.923，P=0.032)。见表2。
表2 HCV.RNA含量与ALT异常的关系(略)
3 讨论
荧光定量PCR诊断技术是一种较为成熟、稳定的技术。它具有定量准确度高、定量范围宽(可达10 7 拷贝·ml -1 )、特异性较高、步聚简单、自动化程度高、操作快速等优点。该技术按常规PCR方式进行体外基因扩增，在反应体系中，荧光探针能与被扩增片段中某一区域特异结合，当引物沿模板延伸至结合处时，荧光报告集团因Taq酶的3′～5′外切酶活性将探针切下来，即释放出激发荧光。仪器根据实时检测到的数据及荧光化学合为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程在单管封闭条件下进行，解决了PCR扩增产物污染和不能定量的问题。通过微机控制，实现了对PCR扩增产物进行实时动态检测和结果的自动分析。资料表明，目前全自动PCR.ELISA内标法系统(COBAS Am-plicor)是公认的、具有良好准确性和重复性的HCV.RNA定量方法 [1] ，但由于设备和配套试剂极其昂贵，很难在临床实验室推广应用 [2] ，而FQ.PCR则避免了这些不足之处，故更适合于临床标本的检测。
本组资料显示，225份HCV.RNA含量高于80拷贝·ml -1 的标本中，抗HCV绝大部分为阳性，且ALT异常率较高，提示这部分病例处于HCV感染阶段。根据文献报道，HCV.RNA定量检测的阳性率比抗HCV的阳性率高 [3] ，而本文的HCV.RNA检测与抗HCV基本一致，其原因可能为:(1)HCV感染早期，体内抗HCV尚未产生或产生的滴度较低不能用现有的试剂检测出;(2)部分病例经过一段时间的抗病毒治疗，病毒复制减弱或停止，血清中已无HCV.RNA存在或病毒载量极低，定量PCR也无法检出，而此时抗HCV仍未消失。本次研究的结果还显示，ALT水平与HCV.RNA含量无明显相关性，但ALT异常率随HCV.RNA含量的升高而增加。因此，我们认为，HCV.RNA和抗HCV及ALT三者联合检测，对HCV感染者的筛选、药物治疗的评价等有较高的临床应用价值。
[参考文献]
[1]DIDOMENICO N，LINK H，KONBEL R，et al.COBAS am-plicor:fully automated RNA and DNA amplification and de-tection system for routine PCR[J].Clin Chem，1996，42(6):1915.1923.
[2]MARIA M，JORDI G，JUAN I E，et al.High-thoughput real-time reverse ranscription-PCR quantitation of HCV.RNA[J].J Clin Microbiol，1999，37(3):327.332.
[3]王志明，谭复明，陈伟华，等.输血后丙型肝炎病毒感染的血清病毒定量研究[J]，中华传染病杂志，2000，18(4):121.123.
[作者简介] 余辉(1968-)，男，江西九江人，讲师。
(九江大学医学院微生物学教研室，江西九江 332000;九江市第三医院检验科，江西九江 332000)
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