细胞因子诱导的杀伤细胞的研究进展
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[摘要] 细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer，CIK)是一种非MHC限制性的新型免疫活性细胞，其增殖能力强、杀瘤活性高、副作用小，优于淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)，对于提高患者自身抗肿瘤免疫能力有重要作用。本文就近年来有关CIK的基础研究和临床应用的进展作一综述。
[关键词] 细胞因子诱导的杀伤细胞;肿瘤;临床应用
Review of cytokine induced killer cells
LI Man，SUN Zai-yang，CHEN Bao-an
(Department of Haemotology，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China)
Abstract:Cytokine induced killer(CIK)is a new kind of immune cells which have non MHC restric-tion，highly proliferation and cytotoxicity.Their activities are superior to lymphokine activated killer cells.Immunotherapy of CIK cells can significantly improve clinical symptoms，but hardly have any side effects.CIK cells also can improve antitumor effects of patients.
Key words:cytokine induced killer cells;carcinoma;clinical application
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer，CIK)是一种非MHC限制性的高效溶肿瘤细胞毒性T细胞。Lanier于1986年首次发现这种细胞(CD3 + CD56 + 细胞)，其在外周血淋巴细胞中的比例为1%～5%，经大量扩增具有杀伤肿瘤活性，是目前最新、疗效最好的肿瘤免疫治疗手段。现将近年来有关CIK的研究进展综述如下。
1 CIK的来源
1.1 CIK的亚型
早在1986年，Lanier等观察到CD3 + T细胞同时表达CD56，即CD3 + CD56 + T细胞群。这种双阳性T细胞按细胞受体(TCR)的不同，进一步被分为CD3 + CD56 + αβT细胞及CD3 + CD56 + γδT细胞两种亚群。
1.2 CIK的存在部位及来源
人CIK在肝脏中最多[占肝内T细胞的(23.6±4.1%)]，其次为外周血(<5%)，但在人的骨髓细胞中至今未发现CIK存在，说明人体具有天然杀伤细胞表面标志的T细胞在肝脏与骨髓是不同的细胞系。关于人CIK的起源目前尚未完全清楚，从一些健康供者的去单核细胞的外周血淋巴细胞[M(-)PBL]中加入IL.2与IL.12，可诱导出CD4 + CD56 + αβT细胞，提示CIK可以被归入原始T细胞。
2 CIK的穿孔蛋白表达及表型
CIK用吉姆萨瑞氏染色，在光镜下呈大颗粒细胞;用免疫过氧化物酶染色，其胞质颗粒中含有穿孔蛋白;用IL.2培养2～3d后，形态学及穿孔蛋白的表达基本无改变，但体积增大，泡内颗粒增多。CIK的表型较复杂，绝大部分表达TCRαβ，小部分表达TCRγδ及CD16;近60%的CIK表达CD8，而30%表达CD4;并且高表达HLA.DR，不表达IL.2α或β受体。
3 CIK的培养及其细胞毒活性的增强
3.1 CIK的培养
3.1.1 IL.12与IL.2协同诱导产生CIK 外周血单个核细胞中加入IL.12与IL.2共同刺激，培养15d后诱导出的细胞，在第20天测定，85%以上是CD3 + CD56 + 细胞。
3.1.2 抗CD3单抗、IL.12与IL.2共同培养产生CIK 在外周血单个核细胞中先加入抗CD3单克隆抗体(简称单抗)，然后加入IL.12与IL.2共同培养，在培养的第20天有85%以上的细胞是CD3 + CD56 + 细胞，但这种培养方法只产生CD3 + CD56 + TCRαβT细胞的增殖，且大多数的CD3 + CD56 + TCRαβT细胞是CD8 + 细胞。
3.1.3 IFN.γ、抗CD3单抗、IL.12与IL.2共同培养产生CIK 在外周血单个核细胞中先加IFN.γ，24h后加入抗CD3单抗、IL.12与IL.2，培养14～21d，培 养14d时即有30%左右的细胞是CD3 + CD56 + 细胞。此法是目前最常用的CIK的培养方法。将含有自身血浆的RPMI1640培养基或AIM.V无血清培养基用于CIK的体外扩增，结果与用胎牛血清培养的CIK在纯度和扩增性能上无显著性差异，用胎牛血清、自身血浆或无血清培养基体外都能扩增较强细胞毒性的CIK [1] 。
3.2 CIK的体外细胞毒活性
CD3 + CD56 + 细胞可以通过MHC限制性溶解大量肿瘤细胞。通过各种单抗对CD3 + CD56 + T细胞对OCI.LY8肿瘤细胞杀伤效率影响的研究表明，其中LFA.1(CD11a)、ICAM.1(CD54)可阻断CIK发挥细胞毒活性，抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD11b抗体和VLA.4抗体对其细胞毒活性几乎无影响，且由于CIK不表达CD16，不具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用。
3.3 CIK细胞毒活性的增强
3.3.1 外源性细胞因子的刺激 Zoll B等 [2，3] 比较了外源性IL.2、IL.7和IL.12对CIK的促增殖效应，结果3种细胞因子都能诱使淋巴细胞迅速增殖，且三者所诱导的CIK的细胞毒活性无明显差异。IL.12诱导产生的CIK绝大多数为CD3 + CD56 + 细胞;IL.7诱导产生的CIK高表达LFA.1/CD11a，此抗原对于CIK的细胞毒活性非常重要，IL.7也是诱导产生最多CD28 + 细胞的细胞因子，CD28 + 细胞能增强TCR的协同刺激作用;IL.12诱生的CIK细胞高表达对杀瘤活性起重要作用的CD56 + 细胞，因此IL.12在CIK细胞培养中所起的作用是举足轻重的。
3.3.2 树突状细胞(DC)和CIK相互作用 Marten等 [4] 将CIK和源于自体外周血单个核细胞的DC共同培养，在与CIK共同培养的DC培养液中，独特型DC及抗原递呈分子的数量明显增加;DC分泌IL.12也明显增加，并使CIK细胞对癌细胞的细胞毒活性明显增强。阻断IL.12对CIK细胞的作用，可以使CIK溶解细胞活性明显减低。实验证明，DC和CIK相互作用使溶解细胞能力进一步增强。在研究DC和CIK共培养对多发性骨髓瘤(MM)细胞的溶瘤活性实验中，CIK对MM细胞表现出极高的溶瘤活性，与抗原独特型DC共培养后此溶解活性得到了进一步增强 [5] 。
3.3.3 IL.7、IL.2基因转染CIK Finke等 [6] 将IL.7基因转染入CIK内，转染后的CIK扩增能力及细胞毒活性明显增强;IL.7的表达使CIK分泌TNF.α增加;与CIK细胞毒活性相关的表面抗原的表达无明显差异。将含有IL.2基因的质粒通过电穿孔的形式导入CIK细胞中，转染后的CIK细胞增殖能力和细胞毒活性更强。
4 CIK的抗肿瘤作用及其临床应用
4.1 CIK抗肿瘤作用的动物实验
给重度联合免疫缺陷病(SCID)鼠注射Su.DHL4(人B淋巴瘤株)细胞建立肿瘤动物模型，分别予CIK及淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)治疗，结果CIK能显著延长小鼠的生存时间，6个月后经RT.PCR检测小鼠的骨髓、脾、肝、肺等器官，未见瘤细胞。
国内研究组对CIK进行了一系列实验，通过观察CIK对S180KM(克洛氏肉瘤)鼠—实体瘤动物模型和H.22(肝癌腹水瘤)鼠—腹水瘤动物模型的体内抗肿瘤实验，与LAK作对比，结果表明CIK有显著的抑瘤作用及抗肿瘤转移作用，CIK与LAK抑瘤作用比差异显著(CIK∶LAK=78∶31);CIK较强的体内抗肿瘤活性可能与其提高荷瘤宿主体内T淋巴细胞的活性有关 [7] 。Wang等 [8] 在CIK抗肝癌的研究中也证实了自体CIK与LAK相比有更强的抗肝癌活性，对肿瘤生长有较强的抑制作用。
有报道将脐血CIK与LAK对K562细胞杀伤活性作比较，证实脐血CIK是显著优于LAK的一类具有非MHC限制性杀伤活力的免疫活性细胞。且脐血具有来源广泛、脐血CIK发生移植物抗宿主病(GVHD)的几率小等优点，故脐血CIK是理想的可用于过继免疫疗法的生力军 [9] 。
4.2 临床应用试验
4.2.1 ASCT后的免疫治疗 Alvarnas等 [10] 对进行自体造血干细胞移植(ASCT)的患者进行了试验，取25例ASCT患者的外周血祖细胞进行体外扩增，培养到第21天时，CD3 + CD56 + 细胞扩增了44.8倍，效靶比为401，其对OCI.Ly8的杀瘤活性在第21天和28天分别为24%和42%。因此经粒细胞集落刺激因子(G.CSF)动员的ASCT患者外周血祖细胞可以扩增出CIK细胞，用于移植后获得性免疫治疗。
4.2.2 IL.2基因转导的CIK的Ⅰ期临床试验 Schmidt-Wolf等 [11] 在Ⅰ期临床试验中证实，经IL.2转导后的CIK细胞具有更强的增殖能力和更高的细胞毒活性。试验中的CIK细胞均源于肾转移癌、结肠癌、直肠癌和淋巴瘤患者的外周血淋巴细胞，将含IL.2基因的质粒通过电穿孔的形式导入CIK细胞中，10名患者接受了转导后的CIK细胞的回输。治疗期间， 血清干扰素.γ(IFN.γ)、粒.巨噬细胞集落刺激因子(GM.CSF)及肿瘤坏死因子β(TGF.β)水平明显增加，且患者外周血中CD3 + 淋巴细胞比例增高，外周血淋巴细胞的细胞毒活性有部分增加，结果6例患者无效，3例病情得到控制，1例淋巴瘤患者达到了完全缓解(CR)。其临床疗效仍有待于进一步探索。
4.2.3 CIK治疗微小残留白血病 童春容等 [12] 对37例急性白血病患者共给予58个疗程的CIK治疗，CIK均源于患者外周血单个核细胞，结果34例血液学缓解期接受CIK治疗的患者其3年持续完全缓解(CCR)率为75%;经1个疗程CIK治疗后，2例(2/3)肿大的脾明显缩小;8例(8/8)骨髓残留的异常染色体和(或)基因标志消失;19例造血干细胞移植后或化疗1年后接受CIK治疗者17例(89%)CCR至今;5例B细胞型急性淋巴细胞白血病(2例骨髓残留IgH或TCRδ重排阳性，1例长期脾大)，在化疗1～2年后接受CIK治疗，其IgH和(或)TCRδ转阴，脾大消失，均CCR至今。另有1例血液学CR的早幼粒细胞白血病患者在CIK治疗后脾大也明显缩小且CCR至今。说明CIK有清除微小残留白血病细胞、防止复发的作用。本实验结果尚显示，CIK的临床疗效与患者体内的白血病负荷大小有关。因此，免疫治疗应在较大程度减少白血病负荷的基础上进行。
另外，自体CIK的临床疗效与细胞总数、CD8 + 细胞、CD3 + 细胞的增殖倍数有关。回输CIK后，CD3 + 细胞增加明显的患者复发率低，而不增加甚至降低的患者均复发。多项研究资料显示，MabCD3与T细胞的CD3.TCR复合体作用后，在IL.2等细胞因子的协同下，可逆转缺陷的T细胞信号传导系统，对抗原致敏过的细胞毒性T细胞的激活作用更强 [13] 。
4.2.4 治疗丙型肝炎 童春容等 [14] 对12例伴有HCV.RNA阳性的急性白血病患者进行了22个疗程的CIK治疗，治疗后12例患者血清HCV.RNA均有一段时间转阴，9例持续转阴;6例治疗前肝功能异常的患者在CIK治疗后肝功能均明显好转。这些结果提示CIK具有很好的抗丙型肝炎作用。
4.2.5 其他方面 Muller等 [15] 还发现慢性粒细胞性白血病(简称慢粒)患者的CIK中bcr/abl融合基因的表达与慢粒的进展有关。通过观察慢粒患者CIK中bcr/abl融合基因的表达，可以预知慢粒由慢性期进展为加速期。因此，可以通过CIK的增殖来预测慢粒的进展。Toporski等 [16] 也发现MDS患者复发时外周血中CIK有所减少，缓解时CIK又有所增加。
4.3 毒副作用
静脉回输CIK的毒副作用较小，主要有低热、乏力等，症状轻微且可自行缓解 [11，12] 。
5 展望
CIK能选择性杀伤肿瘤细胞，无严格的MHC限制性，且CIK的增殖能力强，对病毒感染细胞、恶性肿瘤细胞及异常的自体细胞有一定的作用。特别是对于术后病人，CIK对清除微小转移灶、防止癌的扩散和复发、提高患者自身抗肿瘤免疫能力有重要作用。对于无法手术或对化疗耐受的中晚期肿瘤患者也可起到改善生活质量、延长生命的积极作用。
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[基金项目] 江苏省自然基金(BK99126)。
[作者简介] 李曼(1976-)，女，江苏盐城人，在读硕士研究生。
(东南大学附属中大医院血液科，江苏南京 210009)
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