深低温停循环对大脑皮层神经细胞凋亡的影响
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[摘要]目的 观察深低温停循环对大脑皮层神经细胞凋亡的影响。 方法 取SD大鼠30只，随机分为3组:深低温对照(DHC)组、常温对照(NTC)组和深低温停循环组(DHCA)组，采用大鼠深低温双侧颈总动脉阻断后再灌注模型，在21℃时将双侧颈总动脉阻断60min，再灌注24h后取大脑皮层细胞制成细胞悬液，流式细胞仪分析细胞凋亡改变，电镜观察细胞超微结构的变化，对实验数据进行统计分析。 结果 NTC组有5只死亡。DHC组、NTC组和DHCA组的大脑皮层细胞凋亡率分别为(2.20±0.43)%、(19.23±1.01)%和(4.72±1.02)%，差异有显著意义(P<0.001)。 结论 深低温停循环能增强大脑细胞对缺氧的耐受性，降低和抑制缺血诱发的脑细胞凋亡。
[关键词] 大鼠;深低温停循环;凋亡;流式细胞仪;神经细胞;大脑皮层
Effect of deep hypothermic circulatory arrest on cortex neuron apoptosis of rats
TAO Yun-ming，MO Xu-ming，PENG Wei，QI Ji-rong，QIAN Long-bao，GU Hai-tao
(Department of Cardiothoracic Surgery，Affiliated Nanjing Children Hospital，Nanjing Medical University，Nanjing210008，China)
Abstract:Objective To observe the effect of deep hypothermic circulatory arrest(DHCA)on cortex neuron apoptosis after cerebral ischemia.reperfusion injury in rats.Methods Thirty SD rats were divided randomly into three groups:deep hypothermic control(DHC)group，normal temperature control(NTC)group and deep hypothermic circulatory arrest(DHCA)group.Model of cerebral ischemia.reperfusion injury were prepared by60min occlusion followed24h of reperfusion of bilateral common carotid artery in the deep hypothermic(21℃)rats.Cerebral cortex-es were removed and then dissociated，measured with flow cytometry analyze cell apoptosis.The morphological change were examined by electron microscope.Data were analyzed by software SPSS11.5.Results Five rats of the NTC group died during the experimentation，the rate of apoptosis of DHC group，NTC group and DHCA group were(2.20±0.43)%，(19.23±1.01)%and(4.72±1.02)%respectively(P<0.001).Conclusion The decrease of the rate of neuron apoptosis after deep hypothermic circulatory arrest in rats may be clued to decreased and inhib-ited cell apoptosis after cerebral ischemia.reperfusion injury.
Key words:rat;deep hypothermic circulatory arrest;apoptosis;flow cytometry;neuron;cerebral cortex
自Lewis和Taufil于1953年在深低温停循环下手术治愈1例5岁心脏房间隔缺损患儿以来，深低温停循环(DHCA)已在心脏外科得到广泛应用。但DHCA暂时或永久的神经系统并发症却高达4%～25%，而且其安全时限为45～60min，限制了其在临床上的应用。后来研究发现，这些迟发性的神经系统并发症与脑缺血诱发脑细胞的凋亡[1，2] 有关。研究深低温脑缺血60min后神经细胞调亡的情况对深低温在临床上应用有很大的指导意义。本实验采用大鼠深低温颈总动脉阻断模型，应用流式细胞仪和电镜技术观察深低温脑缺血对神经细胞调亡的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选择健康雄性SD大鼠30只(南京医科大学动物实验中心提供)，体重180～230g，随机分为3组，即深低温对照(DHC)组、常温对照(NTC)组和深低温停循环(DHCA)组，每组10只。
1.2 大鼠DHCA模型制作
大鼠用阿托品0.02mg·kg-1 肌肉注射，30min后按100mg·kg-1 腹腔注射氯胺酮麻醉。完全麻醉后固定大鼠，在导丝引导下气管插管并固定，联接小动物呼吸机，将呼吸机呼吸频率调为120次·min-1 ，压强调到0.02～0.05kPa，吸呼比为13。剃除颈部鼠毛，碘附消毒皮肤，酒精脱碘。先用剪刀纵行剪开颈部皮肤，打开右侧颈部筋膜，从正中打开颈外肌层，分别向左右沿颈外斜肌间隙分离筋膜，找到颈总动脉，从伴行的神经旁游离出动脉并套上丝线。用涂有石蜡油的温度计插入肛门5cm，探测大鼠的体温(大鼠的肛温和脑部的基本近似，通过对大鼠深部体温检测来估计脑部的温度)。当体温降至22℃时停止降温，用动脉夹阻断两侧颈总动脉，使体温维持在(21±1)℃，60min后恢复颈总动脉血流。用电热吹风机给大鼠复温，每分钟体温恢复不能超过0.5℃，大约在30min内将体温恢复到32℃，取动脉血作血气分析，将大鼠放入35℃早产儿培育箱复温，在2h内将体温恢复到38.5℃，维持正常体温4h后放置室温下正常饲养。
1.3 其他模型制作
NTC组在不降温的情况下进行以上操作过程制模，而DHC组的操作同深低温停循环组，但不阻断两侧颈总动脉。
1.4 标本的处理[3]
24h后将大鼠断头处死，迅速开颅，取脑皮层组织50～100mg，400目尼龙网研磨，PBS冲洗过滤，研磨后组织放入离心管中用PBS稀释为10ml，反复吹打，制成单细胞悬液，1000r·min-1 离心5min，PBS洗2次，再加体积分数为70%的乙醇固定，4℃过夜，次日4℃离心去上清，加200μl RNase(RNA酶)(1g·L-1 )，37℃水浴30min，再加500μl PI(碘化吡啶)(25mg·L-1 )染色液，4℃避光条件下染色30min。应用FCM记录氩离子激发光波长488nm处红色荧光，每个样本计数10000个细胞，经FACSC Calibur流式细胞仪检测，Mod-fit LT2.0软件绘制细胞数和凋亡细胞分布图。
同时取1mm×1mm×1mm的脑皮层组织，用5%戊二醛固定4h以上送电镜检测，观察细胞超微结构的变化。
1.5 大鼠神经功能评分
采用Longa的5级评分标准。0级:无体征;1级:动物不能完全伸其前肢;2级:动物肢体瘫痪，出现追 尾现象;3级:动物不能站立，打滚;4级:无自主活动，有意识障碍。
1.6 统计学处理
采用SPSS11.5统计软件(Kruskal-Wallis test)分析，数据进行χ2 检验。
2 结果
2.1 实验大鼠存活情况
在实验过程中，NTC组大鼠有5只因脑缺血死亡，DHC组及DHCA组大鼠无死亡，经检验，3组之间有显著性差异(χ2 =12.0，P<0.05)。
存活的大鼠中，NTC组在运动灵活性方面也较DHCA组及DHC组差，4h后作Longa5级评分发现3组之间神经系统损伤情况存在显著性差异(χ2 =25.49，P<0.01)(表1)。
表1 3组大鼠神经系统功能损害情况(略)
2.2 大脑皮层神经细胞的凋亡率
DHC组、NTC组和DHCA组的神经细胞凋亡率分别为(2.20±0.43)%、(19.23±1.01)%、(4.72±1.02)%，经检验，3组间有显著性差异(χ2 =17.31，P<0.001)。
2.3 电镜观察结果
在透射电镜下可以观察到凋亡小体(图1)，NTC组出现凋亡小体较其他两组明显增多。
图1 大鼠脑皮层细胞凋亡小体×1500 (略)
3 讨论
随着体温的降低，机体的代谢也随之降低。脑部温度的降低可以降低脑细胞的代谢，提高脑细胞对缺氧的耐受，故低温是脑保护的最基本技术。通常按体温的高低将其分为:超深低温(4～16℃)、深低温(17～28℃)、中低温(29～33℃)、轻低温(34～36℃)，将中低温和轻低温统称为亚低温。据文献报道，机体在18～37℃范围内体温降低与脑血流减少存在直线关系，而与脑氧代谢下降呈指数关系[4] ，体温从37℃降至27℃，脑细胞代谢降低至正常的50%，体温降至17℃，其代谢低至正常的8%。
大鼠的大脑供血主要是颈总动脉和椎动脉，两支颈内动脉与两支椎动脉在大脑的基底部形成大脑动脉环向大脑供血，而颈内动脉占脑总供血量的大部分，椎动脉(主要为小脑、延髓、脊髓等生命中枢供血)仅占脑总供血量的小部分。在常温下阻断颈总动脉，由于脑部尚有椎动脉供血，故仍有部分大鼠得以存活，但由于供血量明显不足，故引起脑细胞的坏死和凋亡。在本实验中有5只大鼠在阻断颈总动脉过程中死亡，主要原因是常温脑缺血引起脑细胞的大量急性坏死。NTC组存活大鼠神经系统的损伤较重也与大鼠脑细胞坏死和凋亡有关。
深低温停循环模型是在Sheng等[5] 的两血管阻断法的基础上进行了改进。在大鼠的体温降到17～28℃时将大鼠的颈总动脉阻断，虽然此时大鼠的心脏仍有搏动，但深低温时大鼠的心率、血压都只有正常时的1.5左右，心输出量显著下降，心脏泵血量只有正常时的1.5～1.10。在本模型中虽然还有椎动脉对大脑供血，但此时的椎动脉供血只有正常情况下的1.8左右，而且血供主要集中在小脑、脑干、延髓和脊髓等椎动脉供血区，大脑皮层的血供是通过椎动脉与大脑动脉环间的非常细小的侧支来供给，可见在阻断双侧颈总动脉时脑皮层的供血供氧量极低，基本可以忽略。故这种脑缺血低流量模型可以作为大鼠深低温停循环脑缺血缺氧模型来研究，特别是大脑皮质深低温脑缺血的研究。
细胞凋亡是由于外来因素触发了细胞内预存的死亡程序而发生的细胞自杀过程，是由特定基因控制的细胞自主的、有序的死亡，又称程序性细胞死亡。细胞凋亡是生命的基本特征之一，与细胞增殖共同维持机体正常生长发育和内环境稳定。在多种应激因素如氧化剂、毒素、Ca超载、缺氧以及其他促凋亡活性蛋白作 用下，线粒体释放出细胞色素C，在Apaf.1，d.ATP和ATP存在下活化Caspase.9，导致细胞凋亡的激活:激活凋亡特异性核酸酶能水解DNA，降解细胞骨架蛋白，裂解DNA修复的关键酶———多聚ADP核糖多聚酶等，导致细胞凋亡的发生。通过流式细胞仪检测细胞断裂的DNA是现在常用的检测细胞凋亡的重要方法。
以往的研究报告主要集中在亚低温脑缺血.再灌注后脑神经细胞的凋亡，在深低温条件下的脑缺血.再灌注后脑细胞凋亡尚未见报道。很多资料研究显示，细胞凋亡表达的最高峰时间是24h[1，6] ，可以持续1周左右，故本实验检测大鼠脑缺血.再灌注引起脑神经元凋亡的时间选择在再灌注24h。脑皮层和海马区是脑缺血敏感区，缺血缺氧后脑细胞容易坏死和凋亡。由于大鼠的海马区比较小，细胞数很少，为了能够满足流式细胞仪的检测所需细胞数的要求，我们选用大鼠的脑皮层作为研究对象。本实验研究发现:DHCA组凋亡细胞百分率均明显低于NTC组，提示深低温停循环能够增强脑细胞对缺氧的耐受性，延长对缺氧的耐受时间，减轻脑细胞的损伤及因缺氧而造成的脑细胞的凋亡;但深低温停循环大鼠脑缺血.再灌注后凋亡细胞百分率比深低温对照组要高，提示深低温停循环虽然可以降低脑细胞的代谢提高脑细胞对缺氧的耐受，但不能完全逆转缺血引起的脑细胞凋亡。
[参考文献]
[1]吴国祥，李承晏，李涛，等.亚低温对大鼠脑缺血.再灌注损伤后Bcl.2、Bax和C.fos蛋白表达及损伤神经细胞凋亡的影响[J].中华物理医学与康复杂志，2002，24(10):605.607.
[2]江朝光，齐弘炜，周春喜，等.深低温停循环时不同脑保护方法对海马区神经元凋亡的影响[J].中华胸心血管外科杂志，2003，19(2):100.102.
[3]左连富.流式细胞术与生物医学[M].沈阳:辽宁科学技术出版社，1996.240.
[4]IGARI T，HOSHINO S，IWAYA F，et al.Cerebral blood flow and oxygen metabolism during cardiopulmonary bypass with moderate hypothermic selective cerebral perfusion[J].Cardiovasc Surg，1999，7:106.111.
[5]SHENG H，LASKOWITZ D T，PEARLSTEIN R D，et al.Character-ization of a recovery global cerebral ischemia model in the mouse[J].J Neurosci Methods，1999，88(1):103.109.
[6]陈施艳，张志坚，许国英，等.亚低温对大鼠短暂全脑缺血后神经元凋亡的影响[J].临床神经病学杂志，2003，15(2):129.131.
[作者简介] 陶运明(1972-)，男，安徽安庆人，主治医师，医学硕士。
(南京医科大学附属南京儿童医院心胸外科，江苏南京 210008)
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