还原型谷胱甘肽对内毒素休克兔的保护作用
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[摘要]目的 研究抗氧化剂还原型谷胱甘肽(GSH)对内毒素休克兔早期的保护作用。 方法 16只兔随机分为对照组和GSH组，每组8只。两组兔均于30min内注射大肠杆菌内毒素(LPS)(055:B5)300μg·kg-1 复制内毒素休克模型，GSH组在LPS注射完毕后立即注射GSH200mg·kg-1 ，对照组则注射相同体积的0.9%氯化钠。在0h、1.5h、2.5h、3.5h、4.5h和5.5h分别测定收缩压、舒张压，并采血测乳酸(LD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)。实验结束后取标本进行病理检查。 结果 GSH组在实验后期收缩压和舒张压的降幅比对照组小(P<0.05)。GSH组的NO浓度与对照组相比无显著差异(P>0.05)，在5.5h达50～60μmol·L-1 ，比初始值增高1倍;而MDA、LD浓度的增高GSH组比对照组小(P<0.05)。病理检查两组动物的心脏、肺脏、肝脏和肾脏均有坏死和出血点。 结论 内毒素休克早期给予GSH有一定的保护作用，表现为减缓血压下降和过氧化损伤;但其保护作用并不全面，各主要脏器仍可见坏死和出血灶。
[关键词] 内毒素休克;谷胱甘肽;氧自由基
Protective effects of reduced glutathione on rabbit endotoxic shock
ZHANG Jia-liu ，YU Lei，XU Xin-rong
(Department of Critical Care Medicine，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China;Department of Critical Care Medicine，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing210029，China)
Abstract:Objective To study the protective effects of reduced glutathione(GSH)on early stage of endotoxic shock in rabbits.Methods Sixteen rabbits were divided into control group and GSH group randomly.Each group was challenged by E.Coli LPS(055:B5)in a dose of300μg·kg-1 injected within30min.Rabbits in GSH group were injected with GSH by a dose of200mg·kg-1 after LPS was injected，while the rabbits in control group were injected with0.9%NaCl.The diastolic pressure and systolic pressure were recorded at the time of0h，1.5h，2.5h，3.5h，4.5h and5.5h respectively.At the same time，blood samples were taken for the measurments of plasm lactic acid(LD)，malondialdehyde(MDA)and nitric oxide(NO).Autospy and pathological study were performed soon after the experiment.Results The decrease of diastolic pressure and systolic pressure was fewer in GSH group than that in control group at the later stage of shock(P<0.05).There was no significant difference between the two groups in the level of NO(P>0.05).The concentration of MDA，LD was higher in control group than GSH group(P<0.05).Pathological study showed that there were many hemorrhagic spots and necrosis on heart，lung，liver and kidney slices in two groups.Conclusion GSH given at early stage of endotoxic shock have some protective effects manifested by attenuating the decrease in blood pressure and suproxide injury.Pathological study showed that there were many hemorrhagic spots and necrosis on main organs.
Key words:endotoxic shock;glutathione;free oxygen radical
尽管目前对感染性休克的治疗手段从血流动力学、氧代动力学支持到针对炎症介质的单克隆抗体都已应用于临床，但其病死率仍居高不下。单核.巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞被激活后产生“呼吸爆发”形成大量的活性氧和活性氮是造成组织损伤的主要原因之一[1] 。因此抗氧化剂对内毒素休克的治疗在理论上有重要意义。前期研究已证明，机体的抗氧化能力和内毒素性休克时的生存率呈正相关[2] 。因此，研究感染性休克时抗氧化剂的保护作用有重要意义。本研究以静脉注射大肠杆菌内毒素(LPS)复制内毒素休克模型，在早期(LPS注射完成后)给予还原型谷胱甘肽(GSH)，研究其对内毒素休克兔的保护作用。
1 材料与方法
1.1 动物模型
一级雄性青紫蓝兔16只，体重(2.09±0.11)kg。随机分为两组:对照组和GSH组，每组8只。实验前禁食1晚，但给予自由饮水。2%戊巴比妥2ml·kg-1 静脉注射麻醉后动物固定于仰卧位，右股动脉插管接西门子1260监护仪，实时监测血压并接三通采血。右颈外静脉插管测中心静脉压，并接三通注药、输液。按300μg·kg-1 注射LPS(Sigma公司，血清型055:B5)，30min注射完毕。注射LPS后用生理盐水充分补液，维持中心静脉压于基础水平。GSH组在LPS注射完毕后立即注射GSH(Laboratorio Farmaceutico C.T.s.r.l生产)200mg·kg -1 ，对照组则注射相同体积的0.9%氯化钠。
1.2 标本采集
分别于注药前、LPS注射完成后1h、2h、3h、4h和5h记录收缩压和舒张压，同时经股动脉采血，肝素抗凝，1500r·min-1 离心15min。血浆置-20℃保存。实验结束后处死动物，立即解剖并取心脏、肺、肝脏和肾脏，以10%甲醛溶液固定待检。
1.3 标本检测
测定血浆一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)以及乳酸(LD)的检测试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。均按说明书进行操作。
1.4 统计分析
全部数据由Visual Fox Pro软件录入计算机，在SPSS for Windows软件下进行统计分析，P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 血压的变化
两组血压均呈先下降、再缓慢上升的趋势。对照组下降速度快且收缩压最大降幅达30%;GSH组的血压下降幅度比对照组小，在3.5h后表现有显著性差异(P<0.05)。见表1。
表1 两组动物SBP和DBP的变化(略)
注:1mmHg=0.133kPa;同一时点与对照组比较，* P<0.05
2.2 LD浓度的变化
LD浓度随时间增长而增加，休克5h后，对照组较正常增高(1.94±0.34)mmol·L-1 (P<0.001);GSH组增高(1.28±0.19)mmol·L-1 (P<0.001)。组间在0h和2.5h无显著性差异(P>0.05)，其它各时间段GSH组的乳酸浓度均明显低于对照组(P<0.05)。见表2。
2.3 NO浓度的变化
两组NO浓度均显著升高，休克5h后，对照组较正常增高(40.57±16.3)μmol·L -1 (P<0.001);GSH组增高(26.72±3.46)μmol·L-1 (P<0.001)。但两组组间无显著性差异(P<0.05)。见表2。
2.4 MAD浓度的变化
MAD浓度随时间而增加，休克5h后，对照组较正常增高(1.33±0.22)μmol·L -1 (P<0.001);GSH组增高(0.74±0.16)μmol·L -1 (P<0.001)。GSH能有效地降低血浆MDA的浓度，除0h和2.5h外，其余各时段GSH组与对照组间均有显著性差异(P<0.05)。见表2。
表2 两组动物血LD、NO及MDA浓度的变化(略)
2.5 病理检查结果
两组均发现肠管表面有散在出血点，肺、肝切面也有小片状或点状出血灶，心、肾的切面无肉眼可见的出血。显微镜下各组均有程度不同的损伤，心脏以片状坏死为主，肺脏有肺泡出血，肝脏有片状坏死及气球样变性，肾脏可见肾小管上皮肿胀等。两组间镜下的损伤程度和数量并无明显差别。
3 讨论
目前关于抗氧化剂对内毒素休克或脓毒性休克保护作用的研究主要集中于内毒素攻击造成感染前给药，但对在起病后、尤其是早期给药是否具有保护性作用的研究不多。预先给予GSH已证明可有效地改善内毒素休克时的全身情况，包括氧代谢改善、心脏指数提高、肿瘤坏死因子活性降低等[3] 。体内氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的比值(GSSG.GSH)可较准确地反映机体所承受的氧化应激水平[4] 。因此，理论上凡能降低此比值的因素均具有保护性作用。本次实验在内毒素攻击30min后给予GSH，结果显示抗氧化剂在兔内毒素休克时可起部分保护性作用。
内毒素休克时血管内皮细胞由于吞噬细胞贴壁等反应，过氧化损伤严重，血压调节功能低下。两组动物在注射LPS后1h左右血压降至最低点，随后又缓慢回升。GSH组到实验后期表现出差异性，这说明GSH在脓毒症时具有维持血压的功效。
MDA是自由基攻击生物膜中的多价不饱和脂肪酸引发脂质过氧化而形成的一种醛基物质。其含量可反映体内过氧化的程度，从而间接反映细胞损伤程度。LD的浓度可代表机体的无氧代谢程度，从而间接反映氧代谢情况。由于干扰因素少，有的学者认为LD浓度比其它指标能更准确地反映机体的氧代谢情况[3，5] 。内毒素性休克时由于丙酮酸脱氢酶活性受抑制，不仅LD浓度增加，而且能量代谢的底物大量减少，造成恶性循环。本研究证明，GSH组MDA及LD浓度的升高 均明显低于对照组，说明GSH具有较强的抗脂质过氧化和改善氧代谢状态的作用。
NO在内毒素休克时主要起损伤作用，由体内的一氧化氮合酶(NOS)合成。LPS作用于肝细胞及枯否细胞，刺激后者生成大量编码NOS的mRNA，从而产生大量NO。本实验表明，LPS攻击后再给予抗氧化剂不能有效地减少NO的产生，这可能是因为抗氧化剂不能抑制mRNA的翻译。
研究发现，内毒素休克时心肌内GSH含量减少50%，而补充GSH可直接增加体内GSH池。内毒素休克时大量LPS作为超抗原可直接激活T细胞、枯否细胞等免疫活性细胞，对局部造成的损伤是相当严重的，病理切片上可见大片的坏死。但由于肝脏的代偿功能强大，临床上肝功能损伤的表现没有心、肺功能损伤的表现明显。前期的研究也发现，预先给予GSH也只能在低水平上抑制肝脏脂质过氧化而不能降低死亡率[6] 。GSH的保护作用主要是作为抗氧化剂，其抗氧化的作用位置是在细胞内。体内具有将氧化型谷胱甘肽转变为GSH的酶系统，但内毒素休克时酶活性降低，因此补充外源性GSH显得尤为重要。近年来随着分子生物学的发展，发现了NF.κB这一类DNA转录调控蛋白，它的活性上调可导致包括TNF、IL.1、细胞粘附因子等在内的100多种与细胞免疫反应有关的物质生成量增多[7] 。LPS、缺氧、氧化性应激都是NF.κB的刺激物，而GSH则可直接抑制其活性，从而减少众多炎症介质的释放。
本次实验发现GSH对内毒素休克有一定的保护作用，但其作用是有限的。原因是多方面的，内毒素休克时的损伤不止是过氧化反应。LPS一方面可通过替代途径激活补体，另一方面可作为超抗原直接激活细胞毒淋巴细胞(CTL)等效应细胞，从而造成组织细胞受损。抗氧化剂剂量不足可能也是原因之一。进一步的研究应着眼于抗氧化剂的种类及其最佳给药时机，以利于临床治疗。
[参考文献]
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[7]NEURATH M F，BECKER C，BAEBULESCU K.Role of NF.κB in immune and inflammatory responses in the gut[J].Gut，1998，43(6):856.860.
[作者简介] 张家留(1964-)，男，江苏泰兴人，主治医师，医学硕士。
(东南大学附属中大医院危重病医学科，江苏南京 210009;南京医科大学第一附属医院危重病医学科，江苏南京 210029)
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