直接与间接接触对诱导骨髓间充质干细胞成心肌样分化的影响
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[摘要]目的 观察心肌细胞(cardiomyocytes，CM)与骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells，MSCs)直接接触和非直接接触对诱导MSCs成心肌样分化的影响。 方法 体外以新生大鼠CM与MSCs直接接触和非直接接触的培养方式模拟心肌微环境，分析MSCs形态和结构蛋白表达等方面的变化。 结果 直接接触共培养的MSCs与CM同步搏动，且心肌特异性肌钙蛋白T染色阳性，阳性率为1.3%;而心肌细胞条件培养液无法单独诱导MSCs的横向分化。 结论 与CM细胞间的直接接触是诱导MSCs分化为心肌细胞的必须条件，条件培养液则非关键因素。
[关键词] 骨髓间充质干细胞;共培养;直接接触;条件培养液;分化;心肌;大鼠
Study of the effect of direct and non-direct contact with cardiomyocytes on transdifferentiation of bone marrow stromal cells into cardiomyocytes
WANG Lei，LIN Guo-sheng，GUO Jun，JIANG Xue-jun，YANG Bo
(Department of Cardiology，Renmin Hospital，Wuhan University，Wuhan430060，China)
Abstract:Objective To simulate the effect of direct and non-direct contact with cardiomyocytes on transdif-ferentiation of bone marrow stromal cells(MSCs)into cardiomyocytes(CM).Methods MSCs were cultured in sim-ulated cardiac environment using coculture and conditioned media.Morphological changes and expression of cardiac Troponin T in MSCs were investigated and analysed.Results Only in direct contact group MSCs pulsed synchro-nously with cardiomyocytes and stained positively for cardiac Troponin T，the positive rat was1.3%.Conclusion It is direct cell-to-cell contact not conditioned media that is abligatory for the transdifferentiation of MSCs into car-diomyocytes.
Key words:bone marrow stromal cells;coculture;cell-to-cell contact;conditioned media;differentiation;myo-cardium;rats
骨髓间充质干细胞(MSCs)是目前认为较有希望成为梗死心肌细胞替代治疗的干细胞。MSCs移植后呈微环境依赖性横向分化，表达出心肌特异性蛋白[1] 。但目前尚不清楚微环境的具体诱导机制，究竟是不同细胞间的直接接触还是非直接接触或是二者协同作用影响了干细胞的分化方向不得而知。因此，本实验以心肌细胞(CM)与MSCs直接和非直接接触的培养方式模拟心肌微环境，诱导MSCs成心肌样分化从而探讨 其分化为心肌细胞的机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
1～2d新生SD大鼠，成年SD大鼠(体重120～150g，雌雄不限，本校实验动物中心提供)。
1.2 试剂
DMEM高糖培养基(Sigma公司产品)，胎牛血清(FBS，Hyclone公司产品)，一抗小鼠抗大鼠心肌肌钙蛋白T单克隆抗体(Neomarker公司产品)，二抗TM-RITC.连接的羊抗小鼠IgG(Gibco公司产品)，0.1%Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)，0.125%胰酶+0.02%EDTA(Sigma公司)，倒置荧光显微镜(Olympus公司)。
1.3 取材
1.3.1 CM的取材培养 1～2d的SD大鼠心脏，剪成1mm 3 大小的碎块，加入含0.08%胰蛋白酶、0.1%蚀原酶和0.02%葡萄糖的PBS溶液，反复消化至组织块消化完全。每轮所得消化液离心后用DMEM培养液重悬细胞沉淀。台盼蓝拒染试验计数细胞密度，以1.25×10 5 个·cm -2 接种到放置有盖玻片的培养皿中(37℃，体积分数为5%CO 2 ，95%空气)，在含丝裂霉素C的培养基培养1d，以抑制非心肌细胞增殖，再换为常规培养基，1～2d后用于实验。
1.3.2 MSCs取材培养 方法参照文献[2]，取SD大鼠股骨、胫骨，切除两端，置于Ep管中1500r·min -1 离心1min。平衡盐溶液清洗管底骨髓内容物后用DMEM重悬。接种24h换液除去非贴壁细胞。每3d换液1次，约80%融合时用0.125%胰酶+0.02%ED-TA消化传代。
1.3.3 心肌细胞条件培养液的制备 心肌细胞接种于含10%FBS的DMEM培养基中，收集每日更换所得的培养液，离心后取上清为心肌细胞分泌液，与DMEM培养基以70.30(V.V)比例混合，即得到心肌细胞条件培养液。
1.4 实验分组
取第2～3代的MSCs，实验前于培养液中加入0.002%的荧光染料4，6.二乙酰基.2.苯基吲哚(DAPI)过夜标记细胞，Hanks平衡盐溶液漂洗12次，洗去未结合的DAPI，消化细胞后用血细胞计数板计数并算出细胞密度。心肌细胞经Troponin T免疫荧光染色后计数心肌细胞纯度为75%。实验分组:第一组只有DAPI.MSCs，按5×10 4 ～1×10 5 个·cm -2 细胞密度接种于放置有盖玻片的35mm培养皿中作为对照组;第二组DAPI.MSCs按5×10 4 ～1×10 5 个·cm -2 细胞密度接种于密度为1.25×10 5 个·cm -2 的搏动的心肌细胞中共同培养;第三组DAPI.MSCs按5×10 4 ～1×10 5 个·cm -2 细胞密度接种于放置有盖玻片的35mm培养皿中用上述心肌细胞条件培养液孵育，每1d换液1次，并于37℃，体积分数为5%CO 2 ，95%空气的环境中培养4d。利用数码相机和荧光显微镜对MSCs形态和结构蛋白表达等方面进行观察。
2 结果
2.1 细胞的形态学及生长行为变化
2.1.1 共同培养前MSCs和CM MSCs原代培养接种后第2天出现贴壁细胞，以成纤维样细胞在数量上占绝对优势并逐渐形成集落(图1)。此外，在培养物中还可见少量圆形透亮的造血干细胞、多核巨噬细胞及单核细胞，随着换液而逐渐减少。2～3代后MSCs变得较为同质，大小较均匀(图2)，经DAPI标记后荧光显微镜下计数细胞阳性率为100%。分离的心肌细胞贴壁生长第2～3d伸出伪足相互接触交织成网，逐渐形成细胞簇或细胞单层，搏动呈同步性，搏动频率多在40～60次·min -1 ，未见CM在荧光显微镜下显色。
图1 光镜下原代MSCs ×200(略)
长梭形细胞呈集落样生长
图2 光镜下第2代MSCs ×200(略)
形态一致分布均匀
2.1.2 共同培养后MSCs的生长情况 第二组MSCs呈梭形，第1天平行贴附于单个的或成簇的搏动心肌细胞，部分平铺于皿底;第2～3天荧光显微镜下可见发蓝色荧光的MSCs与心肌细胞一起同步收缩，搏动频率为40～80次·min -1 ，培养皿中各部分细胞搏动频率并不一致，并且MSCs形态逐渐发生变化，体积增大，呈椭圆形或不规则状外观。第一组和第三组MSCs在连续4d的观察中形态未发生改变，没出现搏动。
2.2 免疫荧光染色细胞鉴定
培养4d后取出盖玻片，细胞用PBS洗涤3次，甲醇-20℃固定30min，1%Triton室温下细胞膜打孔30min，1%牛血清白蛋白(BSA)封闭，最后滴加一抗4℃过夜后滴加二抗，室温1～3h行Troponin T免疫荧光染色。MSCs分化为心肌样细胞时，Troponin T免疫荧光染色呈阳性，不同光源激发下其核发蓝色荧光而胞浆呈现红色荧光，为阳性细胞。CM仅胞浆发红色荧光。计算心肌细胞转化率:随机选取8～10个不同的视野，分别计数每个视野内的细胞数及阳性细胞数。计算各个视野阳性细胞数与细胞总数之比，取其均值，即为MSCs分化为心肌样细胞的转化率。MSCs与CM共同培养4d后，Troponin T阳性细胞百分率为1.3%(图3)，第一组和第三组MSCsTroponin T染色阴性。
图3 共同培养后的MSCs免疫荧光染色结果 ×500 心肌胞浆呈红色荧光，分化了的MSCs核呈蓝色荧光、胞浆呈红色荧光并与心肌贴附在一起(略)
3 讨论
将MSCs直接注入活体心脏或在体外将MSCs与心肌细胞共同培养均可以使MSCs向心肌细胞转化，说明心肌细胞本身或(和)心肌细胞的生理环境具有诱导MSCs分化为心肌细胞的作用。而体外实验相对体内实验而言，更具直观性和可控制性。Tomita等[3] 在未使用化学诱导剂情况下，将MSCs与新生鼠CM共同培养发现一部分绿色荧光蛋白(GFP)标记的MSCs出 现自发性收缩，显示MSCs与心肌细胞共培养后能分化成心肌样细胞。有学者将骨骼肌来源的干细胞接种于特殊材料皿上，然后利用外界机械牵拉皿的方式作用于干细胞，通过与对照组比较发现机械牵拉作用为干细胞分化为心肌样细胞的必要条件[4] 。因此，进一步完善模拟心肌微环境的模型将有利于探索干细胞分化为心肌细胞的条件。
微环境对于干细胞诱导的影响机制虽然很复杂，但总的说来自两方面因素:化学刺激和物理(机械)刺激。本实验首先证实MSCs具有分化为心肌细胞的潜能，其次证明直接接触是MSCs分化为心肌细胞的必要条件。而在缺少直接接触情况下化学接触(心肌细胞条件培养液)无法单独诱导MSCs成心肌样分化。提示心肌细胞机械牵拉刺激和(或)细胞间特殊电流刺激是MSCs定向分化为心肌细胞的必要因素。但是这种刺激如何转换成胞内的信号通路等尚有待进一步研究。
随着研究深入，通过体外模拟心肌微环境的模型将有助于探索干细胞分化为心肌细胞的条件，并且通过模拟这些环境因素使尽可能多的MSCs分化为心肌样的甚至是成熟的心肌细胞，为应用于临床治疗心肌梗死等奠定基础。
[参考文献]
[1]WANG J S，SHUM-TIM D，CHEDRAWY E，et al.The coronary de-livery of marrow stromal cells for myocardial regeneration:patho-physiologic and therapeutic implications[J].J Thorac Cardiovasc Surg，2001，122(4):699.705.
[2]LIU Y，SONG J，LIU W，et al.Growth and differentiation of rat bone marrow stromal cells:does5-azacytidine trigger their cardio-myogenic differentiation?[J].Cardiovasc Res，2003，58(2):460.468.
[3]TOMITA S，NAKATANI T，FUKUHARA S，et al.Bone marrow stromal cells contract synchronously with cardiomyocytes in a cocul-ture system[J].Jpn J Thorac Cardiovasc Surg，2002，50(8):321.324.
[4]IIJIMA Y，NAGAI T，MIZUKAMI M，et al.Beating is necessary for transdifferentiation of skeletal muscle-derived cells into cardio-myocytes[J].FASEB J，2003，17(10):1361.1363.
[作者简介] 汪蕾(1979-)，女，湖北武汉人，在读硕士研究生。
(武汉大学人民医院心内科，湖北武汉 430060)
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