丹参酮Ⅰ对ＨｅｐＧ2细胞抑制作用的体外实验研究
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[摘要]目的 通过丹参酮Ⅰ(TanshinoneⅠ)对人肝癌细胞(HepG2)的体外实验，研究丹参酮Ⅰ抗肿瘤作用及作用机制。 方法 HepG2细胞培养液中加入不同浓度的丹参酮Ⅰ，培养72h，观察HepG2细胞的增殖率;倒置显微镜观察HepG2细胞的形态变化;流动血细胞计数(FCM)检测HepG2细胞周期及凋亡率;免疫细胞化学检测HepG2细胞的增殖凋亡调控相关基因bax、bcl.2的蛋白表达。 结果 丹参酮Ⅰ抑制HepG2细胞生长，阻滞HepG2细胞周期于G 0 .G 1 期并诱导细胞凋亡;丹参酮Ⅰ通过下调bcl.2基因表达(P<0.01)、上调bax基因表达(P<0.01)诱导HepG2细胞凋亡。 结论 丹参酮Ⅰ具有抗肿瘤活性，其作用机制之一是诱导细胞凋亡。
[关键词] 丹参酮Ⅰ;细胞凋亡;凋亡基因;肝癌细胞
Study on the inhibiting effect of TanshinoneⅠon HepG2cell line in vitro
ZHENG Guo-can，LI Zhi-ying
(Department of General Surgery，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China;Institute of Tumor，Medical College，Korea University，Seoul136-701，Korea)
Abstract:Objective This study was performed to evaluate the anti-tumor effect and mechanism of Tanshi-noneⅠby HepG2cell line in vitro.Methods The human hepatoma cell(HepG2)was cultured in medium con-taining serial concentration of TanshinoneⅠfor72hours.Then the growth rate and the morphological change were analysed.Cell apoptosis percentage and cell cycle phase distribution were measured by flow cytometrice assay.The expression of proliferation and apoptosis associated proteins of bax，bcl.2gene in HepG2cell were determined by us-ing immunocytochemistry.Results TanshinoneⅠinhibited proliferation of HepG2cell.The cell cycle was arrested in G0 .G 1 phase and apoptosis was induced.The onset of apoptosis was related to the up-regulation of bax and down-regulation of bcl.2in protein level(P<0.01).Conclusion These studies suggest thatTanshinoneⅠhave anti-tu-mor effect and one of the mechanisms is inducing cell apoptosis.
Key words:TanshinoneⅠ;apoptosis;apoptosis associated gene;HepG2cell line
丹参是具有活血化瘀作用的常用中药，具有一定的抗肿瘤活性，应用于治疗肝癌、胃癌、白血病、宫颈癌等多种癌症[1] 。笔者曾利用丹参酒精提取液对人结肠癌细胞(HT.29)、直肠癌细胞(HRT.18)及肝癌细胞(HepG2)进行过体外实验，结果表明丹参对上述癌细胞均有抑制作用[2] 。丹参脂溶性成分包括:丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮、二氢丹参酮等[3] 。现有报道，丹参酮ⅡA具有明显的抗炎、抗氧化、抗肿瘤活性[4] ，丹参酮Ⅰ抗肿瘤作用的研究尚无报道。为进一步研究丹参脂溶性成分的抗肿瘤性，本研究利用丹参酮Ⅰ对HepG2细胞进行体外实验，观察HepG2细胞的生长曲线和增殖率，检测细胞周期、细胞凋亡率及凋亡相关基因bax、bcl.2的表达，以探讨丹参酮Ⅰ的抗肿瘤作用及作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
丹参酮Ⅰ(TanshinoneⅠ)购于中国药品生物制品检定所;HepG2细胞由韩国高丽大学肿瘤研究所提供;DMEM细胞培养液，胎牛血清，抗生素，胰蛋白酶(GIB Co);SP免疫组化试剂盒，小鼠抗人bcl.2、bax单克隆抗体(Santa Cruz Co);流式细胞仪和细胞计数仪(Coulter Co);CO2恒温细胞培养箱(Quene Co);Olympus倒置显微镜。
1.2 HepG2细胞培养
HepG2细胞培养于DMEM培养液(含100U·ml -1 青霉素、100μg·ml -1 链霉素、10%小牛血清)，置于37℃、5%CO 2 的恒温培养箱中，每3d换液传代。
1.3 丹参酮Ⅰ对HepG2细胞生长的影响
对数生长期HepG2细胞，接种于直径35mm的培养皿中，细胞浓度约为6.5×10 3 个·ml -1 。随机分为用药组和对照组，用药组分别加入用二甲亚砜溶解的丹参酮Ⅰ(含0.02%二甲亚砜)0.5μg·ml -1 、1μg·ml -1 、1.5μg·ml -1 ，对照组加入0.02%二甲亚砜，每个浓度3个重复培养皿。培养72h，每24h用细胞计数仪检测癌细胞数。设对照组癌细胞增殖率为100%，用下面公式计算各用药组癌细胞增殖率:增殖率(%)=[(用药组各时段癌细胞数-用药组开始癌细胞数).(对照组各时段癌细胞数-对照组开始癌细胞数)]×100。
1.4 癌细胞形态学观察
倒置显微镜下动态观察培养皿中HepG2细胞用药前后的变化。
1.5 流动血细胞计数(FCM)检测细胞周期
收集对照组和加丹参酮Ⅰ1μg·ml -1 的用药组培养24、48、72h的HepG2细胞，PBS洗涤后，4℃下用75%酒精固定12h以上;离心除去酒精，PBS洗涤，加入10mg·ml -1 RNA酶溶液150μl，37℃水浴30min，加入碘化丙啶(PI)，300目尼龙网过滤后4℃下放置15min，用FCM测定细胞周期各时相细胞的百分比及细胞凋亡率。
1.6 免疫细胞化学检测增殖凋亡调控相关基因bax、bcl.2的蛋白表达
分别收集对照组和加丹参酮Ⅰ1μg·ml -1 的用药组培养48h的HepG2细胞，用S.P法进行染色。小鼠bax单克隆抗体按1∶200稀释，bcl.2单克隆抗体按1∶50稀释，阴性对照以PBS代替抗体。结果判断:细胞染色呈棕黄色为阳性，随机计数100个细胞，测定每一指标的标记指数(labeling index，LI)，重复3次，取均值。LI=阳性细胞数.计数细胞总数×100%。
1.7 统计学方法
所有数据资料用SPSS统计软件分析处理，实验数据采用ˉx±s表示，各组间比较用t检验。
2 结果
2.1 丹参酮Ⅰ对HepG2细胞生长的影响
用药组与对照组相比HepG2细胞数和增殖率减少，均呈浓度和时间依赖性(图1、表1)。
图1 HepG2细胞生长曲线(略)
表1 丹参酮Ⅰ对HepG2细胞增殖率的影响(略)
2.2 癌细胞形态学观察
在倒置显微镜下见用药组癌细胞数明显减少，细胞变小，折光性差;而对照组的癌细胞形态上无明显改变，生长良好。
2.3 丹参酮Ⅰ对HepG2细胞周期和凋亡率的影响
用药组与对照组比较，细胞周期阻滞在G 0 .G 1 期，并出现细胞凋亡，细胞凋亡率随处理时间和用药浓度增加而上升(表2)。
表2 丹参酮Ⅰ对HepG2细胞周期及凋亡的影响(略)
2.4 丹参酮Ⅰ对bax、bcl.2蛋白表达的影响
处理48h后，与对照组相比baxLI增加(t=5.66，P<0.01)，bcl.2LI降低(t=13.06，P<0.01)(表3)。
表3 丹参酮Ⅰ对HepG2细胞bax、bcl.2表达的影响(略)
3 讨论
本研究对HepG2细胞体外实验结果表明，丹参酮Ⅰ能抑制HepG2细胞的增殖。通过观察HepG2细胞的形态，观察到癌细胞生长被抑制。HepG2细胞周期测定结果显示，与对照组相比用丹参酮Ⅰ处理组G 0 .G1 期和细胞凋亡百分率随处理时间和用药浓度增加而上升，这表明丹参酮Ⅰ能阻滞G 1 期细胞向S期移行，使G1 期细胞数量增多。因此我们推测，当细胞周期被阻滞于G1 期时，在药物的作用下，部分HepG2细胞发生凋亡。bax和bcl.2是一对凋亡相关调控基因， bax主要通过与其家族bcl.2形成二聚体而发生作用。
当bcl.2表达较高时，bcl.2和bax形成异源二聚体而抑制凋亡;当bax表达较高时，bax之间形成同源二聚体而促进凋亡[5] 。本实验结果表明，丹参酮Ⅰ作用于HepG2细胞后bcl.2基因表达减弱，bax基因表达增强，说明其可下调bcl.2、上调bax表达，这可能是丹参酮Ⅰ诱导HepG2细胞凋亡的机制之一。从癌细胞体外实验中可得出丹参酮Ⅰ具有抗肿瘤活性，其作用机制之一是诱导细胞凋亡。
[参考文献]
[1]张民庆，龚惠明.抗肿瘤中药的临床应用[M].北京:人民卫生出版社，1998.256.258.
[2]ZHENG G C，LEE J Y，KIME D C，et al.Inhibitory effect of saluia miltiorrhiza extract on growth of some cancer cell[J].Korean Soc Food Sci Nutr，2000，29(4):726.731.
[3]房其年，张佩玲，徐宗沛.丹参抗菌有效成分的研究[J].化学学报，1976，34(3):197.209.
[4]陈坚，林庚金.丹参抗肿瘤的研究进展[J].复旦学报，2003，30(6):626.628.
[5]KORSMEYER S J.Bcl.2gene family and the regulation of pro-grammed cell death[J].Cancer Res，1999，59(7):1693.1700.
[作者简介] 郑国灿(1963-)，男，吉林吉林人，主治医师，医学博士。
(东南大学附属中大医院普通外科，江苏南京 210009;高丽大学肿瘤研究所，汉城韩国 136.701)
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