组织工程化皮肤支架的研究进展
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[摘要] 本文综述近年来国内外关于皮肤支架材料的研究现状，说明只要通过一定的手段对现有材料进行物理或化学的表面改性，提高生物材料对细胞的表面亲和性和相容性等，即可达到组织工程支架对材料的要求。
[关键词] 皮肤组织工程支架;生物可降解;壳聚糖;透明质酸
Advances of researches on scaffolds for skin tissue engineering
WANG Zheng-mei，XIAO Ren-liang，ZHANG Hui
(Laboratory of Medical-Chemistry，Nanjing Information Engineering University，Nanjing210044，China;Department of Wireless，Southeast University，Nanjing210096，China)
Abstract:This review discusses the advances of researches on scaffolds for skin tissue engineering，which have been reported in recent years.It shows that the materials can meet the requirement of scaffolds for skin tissue engineering，only by using suitable technology to change the physical or chemical surface characteristic of present biomaterials and enhance cytocompatibility and cytoaffinity of the biomaterials.
Key words:scaffolds for skin tissue engineering;biodegradation;chitosan;hyaluronate
组织工程学(Tissue Engineering)是20世纪80年代美国科学家Vacanti和Langer提出的新概念，其基本原理是通过种子细胞附着或进入可以降解的生物材料表面或内部，形成一个有生物活性的种植体，当植入病变部位，生物材料被降解吸附时新的组织和器官形成，由此达到修复或重建缺损组织或器官的目的。这与传统的异体移植、以伤治伤的自体移植和人工合成替代品的修复法截然不同，其核心是按照相应组织与器官结构以及功能重建的要求，构建细胞和生物可降解材料的三维复合体，以便形成组织工程化组织和器官。
组织工程学出现以来，已经对多种组织和器官进行研究，包括修复骨、软骨、皮肤、肌腱、神经、血管、肝脏、胰腺等，其中以对骨、软骨和皮肤的研究最多，对皮肤的研究最成功。组织工程化皮肤的研究包括种子细胞的培养、支架材料选取和制备、细胞因子的导入等。种子细胞通常来源于新生儿包皮细胞或患者自体细胞，一定程度上解决了组织工程研究与临床上的种子细胞问题，而且细胞的体外培养技术也已经比较成熟。所以，支架材料是组织工程研究的关键之一，它须为细胞生长增殖提供物质交换、分泌基质、行使功能的空间。理想的组织工程支架应具备:(1)良好的生物相容性和生物降解性，无明显的炎症反应、免疫反应和细胞毒性，在体外以及植入体内后的降解和吸收速度应该与细胞和(或)组织生长的速度相匹配;(2)具有足够的力学强度，材料不会在患者活动中塌陷、撕裂、破溃;(3)高孔隙率、高表面积，便于细胞的粘附和导入及营养和代谢产物的交换;(4)表面(包括内表面)亲和性良好，材料表面的化学结构、亲.疏水性、拓扑结构(粗糙度、孔洞的大小及其分布、沟槽的深度宽度、纤维的粗细)、电荷状况(电荷的性质、密度)、表面负载的活性因子等有利于细胞的粘附、铺展、繁殖等;(5)可塑性强，易于加工成各种形状和结构;(6)易于消毒。
1 各种皮肤支架材料的研究现状
1.1 胶原类天然材料皮肤支架
胶原是哺乳动物体内结缔组织的主要成分，结缔组织的强度和韧性主要依靠它来维持。胶原纤维由胶原蛋白构成，其结构有多种类型，Ⅰ型胶原存在于皮肤、韧带、肌腱等组织中，是最容易得到、应用最多的一种。胶原应用于组织工程化皮肤具有独特的细胞亲和性优势。
将原代培养的人包皮成纤维细胞接种在胶原海绵膜上，培养3d后接种原代培养的表皮细胞，构建复合皮肤后移植到裸鼠全层皮肤缺损处，结果表明表皮细胞和成纤维细胞继续增殖分化，复合皮片可获得良好的贴附;新生的皮肤瘢痕增生小，形态好;免疫组织化学染色切片证实已有完整的基底膜生成，创面愈合的速度和质量均优于无细胞接种的胶原海绵膜[1] 。研究结果表明，胶原海绵支架比较适合皮肤细胞的生长。Hafe-mann等[2] 将新型的胶原.弹性蛋白膜三维支架覆盖于伤口，3星期左右血管已经在膜上完全分散，将角朊细胞种植在该膜上，6d后出现淋巴细胞郎格罕细胞，8～11d可以覆盖47%的创面。这种三维基质的特点在于可以立即使用，允许移植，是一种很有前途的真皮替代物。
胶原作为皮肤支架材料很容易降解，过早失去其作为支架应该具有的支撑和提供空间的作用。为调节胶原的降解性能，模拟天然皮肤的组成，可以在皮肤支架中加入氨基葡聚糖(GAG)等多糖类化合物。GAG类化合物包括硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸已酰肝素、肝素、硫酸角质素和透明质酸等。在人工皮肤中应用得最普遍的是6.硫酸软骨素，如无细胞人工真皮替代物Integra○ R (美Integra Life Science公司)，上层是有机硅弹性体，下层由胶原.GAG多孔膜组成，6.硫酸软骨素约占10%，它具有增强胶原抵制酶解的作用。这种产品是以源自动物体的胶原(collagen)为主要成分，掺以少量多糖(GAG或者壳聚糖等)，从而达到调节胶原降解性能的目的。
含细胞的胶原组织工程化复合皮肤的典型代表是Organo-genesis公司的Apligraft产品[3] ，它由真皮与表皮双层结构组成，成纤维细胞接种于胶原海绵体中，体外培养得到真皮层，在真皮层上培养角质形成细胞而得到表皮层。Charles等[4] 用猪做动物模型，将角朊细胞种植于胶原.粘多糖基质上覆盖伤口，14d后观察表皮厚度可达到309μm，表皮融合率可达到98.8%，基质可逐渐血管化，该方法通过活体组织取材获得角朊细胞后4h即可覆盖伤口，避免了患者的痛苦。Butler等[5] 作了类似的研究，14d表皮融合率为96%，平均表皮厚度为180μm，表皮层细胞可达到14层，21d观察到表皮.真皮的连接。
为了改进粘多糖与胶原的结合情况，Hanthamrongwit等[6] 用EDC作为交联剂将硫酸软骨素交联到胶原凝胶上，改善胶原的细胞培养特性。结果发现，硫酸软骨素的加入刺激了人角质细胞在材料上的生长速度，但培养过程中硫酸软骨素会从胶原上脱落下来，降低了刺激细胞生长的速度。为了获得一种可修剪的生物降解性和生物利用度很好的胶原.粘多糖基底材料，必须控制交联的过程。近年来，将胶原与其他天然高分子材料复合制备成交联材料，应用于皮肤移植，例如胶原.几丁质复合物，胶原.脱乙酰几丁质复合物。
1.2 壳聚糖类天然材料皮肤支架
壳聚糖是一种天然聚阳离子生物多糖，具有特殊的物理、化学和生物学特性。壳聚糖有良好的生物降解性和生物相容性，常用作人工皮肤支架，并在临床上用作皮肤覆盖物敷料。
溶液或凝胶冻干方法可制得多孔支架，改变冷冻干燥的条件可控制支架孔径在1～250μm。李沁华等[7] 采用致孔剂聚乙二醇控制膜内孔结构，结果表明致孔剂的相对分子质量为 2000、用量为0.8%时，壳聚糖多孔高分子材料内部孔尺寸为1.84μm，孔洞体积分数为196.5%，含水率为66.23%，保液量为2.09g·g-1 。马建标等[8] 采用冻干法获得特殊的双层壳聚糖膜，成纤维细胞在此膜上进行培养，4周后具有大孔的膜底已有大量细胞增生，而且膜的尺寸和外型保持稳定。具有真皮和表皮的复合壳聚糖人工皮肤移植到家兔的全层皮肤缺损处，创面愈合良好，无明显免疫排斥反应，2个月后表皮结构清楚，角质层较厚，真皮血管较多，无明显的炎性细胞，新生纤维明显增多。结果表明，复合的人工皮肤动物体内修复实验的效果良好，可以考虑作为下一步临床实验的材料。Fwu.long等[9] 研究了非对称的海绵状壳聚糖膜，它的新颖之处在于利用了相间的浸透.析出的相分离方法，从而制出上层孔小下层孔大的非对称的壳聚糖膜，大、小孔层的厚度可以通过预蒸发的方法来控制。此膜覆盖创面后创面愈合很快，21d时膜不再粘附，此时已经有70%的创面愈合。
以壳聚糖为主要原料复合其他材料，通过不同加工方法制备皮肤支架是皮肤支架材料研究的重点。叶春婷等[10] 利用壳聚糖、明胶和甘油为基本原料，与戊二醛交联制备出无色透明的膜状人工皮肤，是多孔的网状纤维半透膜。动物实验证明其具有良好的组织相容性。壳聚糖.胶原.糖胺聚糖凝胶类支架与成纤维细胞复合构建真皮替代物(DE)，随后在成熟的DE表面接种角质细胞(KC)进行培养，构建成功完整的人工皮肤。结果显示，真皮的浸没培养将发生一定程度的收缩，气液界面培养后人工皮肤具有结构致密的真皮和分化良好的表皮，但强度不能令人满意[11] 。Denuziere[12] 研究了在壳聚糖中混入硫酸软骨素、透明质酸类的粘多糖的细胞培养情况，结果显示纯的壳聚糖要比混合物具有更好的细胞粘附性和细胞增殖性。利用透明质酸对壳聚糖和明胶的膜或海绵支架进行表面修饰或者在溶液状态下共交联改性，改性膜或支架具有较好的弹性和细胞亲和性，材料的降解速度减慢，人的成纤维细胞在膜或海绵支架上的贴附和增殖情况非常好。Chung[13] 将壳聚糖和半乳糖交联，再与海藻酸钠共混交联得到凝胶，然后冷冻干燥制得海绵。壳聚糖.半乳糖的加入使得海藻酸钠海绵的力学性能更好，对于细胞来说具有更好的生存环境。
1.3 透明质酸类天然材料皮肤支架
透明质酸(HA)是皮肤组织的主要成分之一，皮肤内只要含有足够量的透明质酸就可以防止皮肤的衰老、脱水，抑制纤维化;而且可以促进创伤愈合，抑制胶原过度沉积而导致的瘢痕。但是作为皮肤支架其易于降解，为了延长它在创面作用的时间，减少降解率，可以将HA与其他天然高分子复合。
Galassi[14] 研究了HA为基质的皮肤支架，将成人的成纤维细胞种植于三维结构的HA支架材料进行体外培养后移植。临床第1例用于皮肤瘤，移植3周后表面覆盖情况较好;12个月后皮肤表面具有正常皮肤的弹性特点，没有太多的瘢痕。第2例是用于急性深度褥疮溃疡，移植3周后伤口中出现了肉芽组织并开始愈合;8周后溃疡愈合，材料被吸收而且形成上皮组织。
Glass等[15] 利用化学修饰方法用多肽(Arg-Gly-Asp)对交联HA的三维多孔海绵进行改性，使海绵材料表面具有更好的细胞亲和性，促进细胞在材料上的增殖。结果表明，改性过的支架上MG63细胞增殖比没有改性的好。Cardona[16] 研究了透明质酸苯甲酯膜的水挥发性和透气性能，结果表明，透明质酸苯甲酯比同条件的商业敷料具有更好的水挥发性和透气性能。明胶和透明质酸钠交联形成可降解性膜作为角朊细胞生长支架，水和营养物质易于透过，临床应用优于胶原膜，能更好地促进伤口愈合。HA作为皮肤支架材料，缺点在于价格高、易于降解，优点在于和细胞的亲和性好，而且可以抑制胶原的过度增生、减少瘢痕，具有皮肤美容的作用。
1.4 其他支架材料
常用皮肤支架材料还有明胶，海藻酸盐，生物可降解的合成高分子如聚乳酸网(PLA)、PGA等和不可降解的尼龙网等。Hye等[17] 利用水作为介质，通过冷冻干燥的方法将明胶制成多孔的明胶膜，其孔结构可以通过改变冷冻干燥的条件来改变，-20℃时可形成(250±120)μm的孔，且是三维结构;-80℃时，孔变为(85±35)μm且是相通的二维结构，用液氮冷冻，孔径变为(45±5)μm的二维结构。Pellegrini等[18] 使用纤维蛋白作为细胞培养基质，确保最终应用于覆盖伤口的角朊细胞中含有大量干细胞，临床结果表明角朊细胞的增殖、分化都比传统方法有了很大改善，可永久性覆盖伤口，但是强度太差。由于尼龙网不可降解，只能作为暂时性创面覆盖物。Philips[19] 使用PLA作为真皮替代物，将成纤维细胞种植在PLA上，覆盖伤口，2～4星期内PLA因生物降解而消失，目前FDA已经批准应用于临床。利用聚乙醇酸网(PGA)重建皮肤已经进行了广泛的研究，临床实验证明其作为真皮移植物是可行的。
2 皮肤组织工程支架材料亟待解决的问题
首先，从材料的选取方面来讲，要作为永久性的皮肤替代物必须是可降解的生物材料，材料本身对组织应该没有免疫原性，而且材料降解的产物对生物组织应该没有毒性或异常效应。胶原虽然对细胞的亲和性好，但会有免疫原性，且价格较高，力学性能较差，需交联后使用。可利用不同的交联方法或交联剂，或者添加改变胶原降解性能的其它纤维类的生物材料来提高胶原类支架的强度，并改变免疫原性。壳聚糖是一种来源很广的生物材料，具有很好的生物相容性，没有免疫原性，还具有较好的抑菌性，可以和其他带负电的高分子作用形成具有很高力学性能的支架材料。HA是皮肤中含有的多糖，与细胞的亲和性好，而且可以抑制胶原的过度增生、减少瘢痕，可用作支架或作为皮肤支架材料的辅助材料发挥其特有的功能。PLA是最早用于皮肤支架的合成高分子，分子的结构易于控制，最大的缺陷在于细胞的相容性差。PGA也存在同样的生物相容性问题。
其次，不同加工方法可制作不同的皮肤支架，凝胶、风干膜、海绵等都各有特点。凝胶材料生物学特性较好，但抗拉强度不够，手术难度较大。风干膜内没有孔或是孔径不符合细胞生长的要求，不适合作为真皮支架，可以作为表皮替代物或敷料。海绵支架材料力学性能可以达到要求，角朊细胞的培养情况很好，成纤维细胞在表面生长较好、孔内生长的较少，但可以 通过对支架材料改性来提高材料对细胞的诱导性。在人工皮肤移植过程中，由于组织工程皮肤常常没有血管系统供给营养，表面的上皮容易坏死脱落[16] 。因此，作为皮肤支架的材料要求细胞外三维基质更容易诱导毛细血管和血管的生成，而且血管和毛细血管长入基质后不会改变其形状和尺寸。复合的海绵支架材料可能更适合全皮培养。
所以，在选取皮肤支架材料时，最理想的应该是具有一定强度、生物相容性和细胞亲和性好的天然高分子，最好是能够释放促进细胞发育的生长因子，或可以抑制细菌的生长，部分缺陷可以通过添加适量具有特殊功能的物质来弥补，如添加HA可以减少瘢痕，接上多肽可以提高材料的细胞贴附性以及在支架材料加工成型后使其具有多孔的三维结构，易于细胞的长入、营养物质和代谢物的交换等。
3 展望
尽管各国在皮肤组织工程支架方面开展了大量研究与开发工作，特别是对各种可吸收多孔支架、膜、凝胶等材料进行了深入探索，研究和开发了多种支架材料，而且有些已经商品化，但由于存在生物相容性、细胞亲和性、免疫原性及力学性能等问题，还没有一种令人十分满意的皮肤支架材料在临床上广泛推广。随着组织工程和材料工程等技术的不断发展，有望在不久的将来研制出生物相容性和细胞亲和性好、力学性能较高且易手术和没有免疫原性的皮肤支架材料作为皮肤替代物，为皮肤烧伤患者带来福音。
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[基金项目] 南京信息工程大学基金资助项目(QD07)。
[作者简介] 王正梅(1970-)，女，江苏淮安人，讲师，在读博士研究生。
(南京信息工程大学药物化学实验室，江苏南京 210044;东南大学无线电系，江苏南京 210096)
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