ＣＩＫ细胞在恶性血液系统疾病中的应用研究
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[摘要] 细胞因子诱导的杀伤(Cytokine-induced killer，CIK)细胞是一种非主要组织相溶性复合体(MHC)限制的免疫效应细胞，同时表达CD3和CD56。CIK细胞可以由人外周血的单个核细胞在体外经与多种细胞因子和CD3单克隆抗体共同培养获得，其增殖能力强、杀瘤活性高、副作用小，是目前恶性血液病细胞免疫治疗中最具前景的细胞之一。
[关键词] 细胞因子诱导的杀伤细胞;临床应用;血液肿瘤
Application of CIK cells to malignant hematological disease
SUN Yun-yu，CHEN Bao-an
(Department of Haemotology，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China)
Abstract:Cytokine-induced killer(CIK)cells are CD3 + CD56 + non-major histocompatibility complex(MHC)-restricted immune effector cells which have highly proliferation and cytotoxicity against a variety of tumor cell targets.CIK cells can be generated by incubation of peripheral blood mononuclear cells with anti-CD3mono-clonal antibody(MoAb)，interleukin.2(IL.2)and interferon-gamma.They hardly have any side effects.CIK cells are promising for future immune therapeutic on hematological tumor.
Key words:cytokine-induced killer cells;clinical application;hematological tumor
细胞免疫治疗的研究始于20世纪80年代，人们陆续研究了淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞、CD3单克隆抗体(简称单抗)激活的杀伤(CD 3 AK)细胞等，体外研究均具有一定的杀瘤活性，但是由于细胞的扩增倍数低，细胞毒力不强，故其临床应用受到很大的限制。1991年美国斯坦福大学医学院的Schmidt-Wolf等[1] 报道了具有高增殖能力和高细胞活性的CIK细胞，它是将人外周血或骨髓单个核细胞在体外用多种细胞因子与CD3单抗共同培养一段时间后获得的一组异质细胞，同时表达CD3和CD56，也称自然杀伤(NK)细胞样T淋巴细胞，它同时具有T细胞的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点。CIK细胞是目前恶性血液病细胞免疫治疗中最具前景的细胞之一。
1 CIK细胞的来源
CIK细胞是人血液或骨髓的单个核细胞在体外经与多种细胞因子和CD3单抗共同培养获得，其单个核细胞可以有不同的来源，包括白血病患者的骨髓或外周血单个核细胞、健康供者的外周血单个核细胞和脐血单个核细胞。
1.1 来源于白血病患者的单个核细胞
Christine等[2] 从13名慢性髓细胞性白血病(CML)患者的外周血单个核细胞中成功扩增出CD3 + CD56 + 的CIK细胞群，培养第21～28天CD3 + CD56 + 细胞平均扩增25倍(2.2～525倍)，全部患者的外周血单个核细胞在培养开始时细胞遗传学检测均为Ph(+)，培养至第21～28天，12名患者Ph(-)。他们的研究显示CML患者CIK扩增倍数低于正常供者，但与淋巴瘤患者CIK扩增倍数相近，CIK扩增的倍数与患者的异质性有关而与培养条件无关，而且与培养起始时CD3 + 或CD3 + CD56 + 数无关，也与以往的治疗无相关性，从高白细胞的患者或原始细胞比例增高的患者中均可培养出Ph(-)的CIK细胞。值得注意的是2例来自患者冻存外周血的细胞扩增不理想。
1.2 来源于正常供者的单个核细胞
Schmidt-Wolf等[3] 从正常供者的外周血单个核细胞培养CIK细胞，培养14d时CIK细胞的T细胞受体α.β阳性，CD3 + CD56 + 的CIK细胞为28.5%，培养前后CIK细胞扩增1071倍。Schmidt-Wolf等的研究显示CIK细胞比LAK细胞的扩增更快，且具有较LAK细胞更强的对肿瘤细胞株的溶细胞活性，CIK介导的细胞溶解作用是非MHC限制性的。
1.3 来源于脐血的单个核细胞
黄倩等[4] 用脐血单个核细胞第1天加入γ干扰素(IFN.γ)，第2天加入白细胞介素.2(IL.2)、CD3单抗，培养4d后获得脐血CIK细胞。脐血CIK细胞对K562细胞的杀伤活性强于CD3AK，两组的杀伤率分别为76.85%、71.18%;且脐血CIK细胞的培养上清对K562细胞的杀伤活性也优于CD3AK，两组的杀伤率分别为35.92%、29.05%。短期培养的脐血CIK细胞的增殖活性低于CD3AK，但加入粒细胞集落刺激因子(G.CSF)可显著提高CIK细胞的增殖数量。
2 CIK细胞的制备方法
目前诱导CIK细胞的方法有多种，主要区别在于细胞因子的组合不同。CD3单抗和IFN.γ是必要的组分，CD3单抗起到丝裂原活性的作用，可以与T细胞表面的CD3交联，诱导细胞活化，而IFN.γ可以诱导IL.1等细胞因子的合成。其他的细胞因子尚有IL.1、IL.2、IL.7、IL.12等。国内王文红等[5] 比较了3种方法诱导的CIK细胞在细胞表型、增殖活性和细胞毒性3个方面的异同。用RPMI1640调整外周血单个核细胞至2×10 6 ·ml -1 ，第1天每组均加入重组人IFN.γ至终浓度为1000U· ml-1 ，置37℃、体积分数为5%CO 2 细胞培养箱中培养，24h后 加CD3单抗25μg·L -1 ，各组再分别加入重组人白细胞介素:第1组IL.1100U·ml -1 ，IL.2300U·ml -1 ;第2组IL.2300U·ml -1 ;第3组IL.12100U·ml -1 。各组加入以上细胞因子后继续培养，每3～4d换新鲜培养液，调整细胞数为2×10 6 ml -1 ，同时分别补加3种白细胞介素。于第14天收集细胞检测。3组CIK细胞的生物学性状以流式细胞仪检测其CD3、CD4、CD8、CD16、CD56的表达，IL.1和IL.2联合组CD4细胞的百分率高于其他两组，IL.12组CD3细胞的百分率低于其他两组。CIK细胞的增殖能力方面，IL.12组的略低于其他两组，另外两组间无差异。用LDH释放法测定CIK细胞的细胞毒性，结果显示3组CIK细胞在杀伤活性上不存在明显差异。结果表明，CIK培养时加入IL.1不能增加细胞的增殖能力，CIK细胞的诱导方法可以简化，目前多数实验室均采用IFN.γ、CD3单抗和IL.2联合应用制备CIK细胞[2] 。
CIK细胞应用于临床一方面要保证足够的数量，另一方面要保证CIK细胞较强的生物学活性和减少感染的机会。北京大学石永进等[6] 在CIK细胞的培养中采用1000ml的大容量培养袋，用一次性注射器进行细胞的定量加样、取样，换液时将培养袋在大容量离心机中离心1000r·min -1 10min，再用分离夹挤出上清，新配好的培养液经输液管插入培养袋进液管后输入培养袋，密封后放入37℃恒温箱培养。这种培养方法操作更简单，污染机率大大降低，使回输更安全。
3 CIK细胞体内、体外的应用研究
CIK细胞的制备技术已相当成熟，其在实体瘤的应用已有陆续报道[7] ，但在恶性血液系统疾病的应用较少，多数研究尚在实验室阶段。
3.1 CIK在急性髓细胞性白血病的应用研究
新加坡的Linn等[8] 利用急性白血病患者诊断时的单个核细胞扩增出CIK细胞，培养后CD3 + CD56 + 细胞百分率为7.6%～65%(平均35.3%)，这些细胞可以杀死人类NK细胞的靶细胞K562细胞。Linn等观察到该CIK效应细胞能够溶解自体急性单核细胞性白血病(AML)靶细胞，并且能够产生抗异体白血病原始细胞的细胞毒作用。该研究提示，CIK细胞在AML的细胞免疫治疗、AML的残留病灶、异基因移植后供体淋巴细胞输注和化疗复发的患者具有广泛的应用价值。Linn等[9] 在另一项研究中用正常供者的异体CIK细胞输注给荷白血病的小鼠，该异体CIK细胞不诱导移植物抗宿主病(GVHD)，而且可以延长荷瘤小鼠的生存期。该研究同时显示CIK细胞可以与树突状细胞(DC)相互作用增加细胞的抗瘤活性。
3.2 CIK在急性淋巴细胞性白血病的应用研究
北京人民医院张乐萍等[10] 临床应用CIK细胞与IL.2联合治疗儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)微小残留病灶(MRD)。他们选择28例化疗12个月后MRD仍阳性的儿童ALL患者，其中14例为CIK治疗组，另外14例为对照组。CIK的输注方法为:取培养10d的自体CIK细胞，如霉菌、细菌培养阴性，活细胞大于95%，分2d通过输血器回输给患者，回输CIK的次日起给予IL.25×10 5 IU·d -1 皮下注射，共5～10d。回输细胞数为(8～27)×10 9 。每2个月进行骨髓形态学、MRD检测。结果显示，14例应用CIK.IL.2治疗1～4个疗程，输注过程中无一例出现寒战、发热、过敏，对心肺功能影响不大;输注后外周血白细胞略有升高，血红蛋白和血小板无变化，说明CIK治疗具有安全性。治疗组随访5～33个月无一例复发，生存时间超过30～54个月，且骨髓形态学和MRD检测均为阴性，1例脾大者也于治疗后回缩。对照组8例复发死亡，两组复发率比较差异有显著性。
3.3 CIK在慢性髓细胞性白血病的应用研究
Scheffold等[11] 将CML患者的外周血淋巴细胞制成CIK细胞，该CIK细胞对自体和异体的CML肿瘤细胞都有明显的杀伤活性。Christine等[2] 从13名CML患者的外周血单个核细胞中扩增出CD3 + CD56 + 的CIK细胞群。其中4名患者的CIK细胞可以抑制自体CML原始细胞的克隆生长，该研究同时显示来自正常供者的异体CIK细胞也可以抑制CML的克隆生长。在培养开始时细胞遗传学检测均为Ph(+)，至培养的第21～28天，12.13患者Ph(-)。这提示恶性细胞在CIK培养的条件下死亡了，它表明Ph(+)的前体细胞在理想的培养条件下被净化了。
3.4 在其他血液肿瘤中的应用
石永进等[6] 应用自体CIK细胞对5名恶性血液系统肿瘤患者进行治疗，包括多发性骨髓瘤(MM)2例、非霍奇金淋巴瘤(NHL)1例、早幼粒细胞白血病(APL)1例、急性非淋巴细胞白血病(AML M4)1例。自体CIK细胞的回输总量在1.6×10 10 以上，分2～3次回输，回输时患者未出现明显毒副反应，回输后进行心、肝、肾等器官功能检测未出现新的异常。随访22～26个月，其中APL患者CIK治疗前PML.RARα融合基因为阳性，CIK回输后转为阴性，2年后检查仍为阴性;除AML M4患者复发外，其他患者均正常，未见复发。
3.5 CIK在经过自体移植的白血病患者的应用
Alvarnas等[12] 取25例经过自体移植的白血病患者的供者干细胞(PBPC)标本，用常规方法在第21天培养出CIK细胞，扩增倍数44.8倍，在第21和28天，其特异性溶瘤作用分别为24%和42%。两名AML患者的CIK细胞对OCI.LY8的抗瘤作用分别为39%、78%。而对自体白血病细胞的溶瘤率分别为26%、58%(效靶比40∶1)。该研究显示经过自体移植的血液病患者，用G.CSF动员的外周血单个核细胞可以扩增出CIK细胞，因此CIK可以成为移植后患者的一种有效的免疫治疗手段。
目前有关CIK细胞对靶细胞的杀伤原理还不完全清楚，Bela等[13] 认为CIK对靶细胞的杀伤有两条途径:一是CIK细胞被淋巴细胞功能相关抗原.1(LFA.1)有关识别机构激活，导致胞浆毒性颗粒依赖性的溶细胞作用，这条途径与胞浆内环磷酸腺苷(cAMP)浓度无关;二是CIK细胞表面的CD3样受体被结合 而激活CIK细胞产生胞浆毒性颗粒介导的溶细胞作用，这条途径与胞浆内cAMP水平有关。CIK细胞因其高增殖活性以及回输时IL.2的低依赖性，使其成为现阶段细胞免疫治疗中最具应用价值的方法之一。
[参考文献]
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[作者简介] 孙耘玉(1966-)，女，河南洛阳人，主治医师，讲师。
(东南大学附属中大医院血液科，江苏南京 210009)
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