双抗体夹心ELISA检测肺炎支原体抗原方法的建立及临床应用
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[摘要]目的 建立检测肺炎支原体抗原的双抗体夹心ELISA，探讨其临床应用的可行性。 方法 采用不同株Mp单抗，用双抗体夹心ELISA法检测Mp抗原，优化该方法检测Mp抗原的最佳实验条件。对Mp标准株及147份临床标本进行测定，观察双抗体夹心ELISA方法的敏感度和特异度，以及该方法与聚合酶链反应(PCR)检测法的符合率。 结果 包被单抗量为20μg·ml -1 ，酶标记单抗1∶200稀释时，阳性对照与阴性对照吸光度之比(P.N值)最大;检测Mp抗原敏感度达2μg·ml -1 ，和其它支原体没有交叉反应。147份临床标本PCR检测阳性率为13.6%(20.147);双抗体夹心ELISA法检测阳性率为12.2%(18.147)，两者符合率达95.9%。 结论 建立的双抗体夹心ELISA法检测Mp抗原具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点。
[关键词] 肺炎支原体;单克隆抗体;ELISA双抗体夹心;聚合酶链反应
Establishment of antibody-sandwich ELISA method for detection of Mycoplasma pneumoniae antigen and its clinical application
TU Shao-hua;YE Yuan-kang;SHEN Zhao-zai
(Department of Laboratory，Tongji Hospital，Tongji University，Shanghai200065，China)
Abstract:Objective To establish antibody-sandwich ELISA method for detection Mycoplasma pneumoniae(Mp)antigen and evaluate its value for clinical application.Methods By using different Mp strains and mono-clonal antibodies specific to Mp antigens，a new antibody-sandwich ELISA method for Mp antigen detection was es-tablished.Standard Mp strains and147clinical samples were examined by ELISA and polymerase chain reaction(PCR)methods in order to observe sensitivity and specificity of ELISH and coincidence rate between the results of ELISA and PCR methods.In antibody-sandwich ELISA method，the optimal concentration of capture McAb(5B9)was about20μg·ml-1 ，and the optimal enzyme-conjugation was1∶200.The minimal Mp antigen which could be detected by this method was2μg·ml -1 .In the147clinical samples，20were positive detected by PCR method and18were positive detected by the newly established method，respectively.The coincidence rate of these two methods was95.9%.Conclusions The Mp antigen detection method have characteristics of fast to get result，easy to han-dle，and high sensitivity and specificity.
Key words:Mycoplasma pneumoniae;monoclonal antibody;antibody-sandwich ELISA;polymerase chain reac-tion
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)的检测方法主要有3类:一是分离培养法，它是证实感染的“金标准”，但Mp的生长极为缓慢，培养周期长，且对培养基营养要求高;二是血清学方法即采用酶免疫法(EIA)、微量免疫荧光法(MIF)和间接血凝试验(IHA)等，检测被检者血清中Mp抗体水平，可间接提示Mp感染的存在，但Mp与生殖支原体(Mycoplasma genital，Mg)存在交叉反应;三是利用分子生物学技术检测Mp-DNA的存在，其中最常用的是聚合酶链反应(PCR)技术，该方法快速、灵敏、特异，是目前研究Mp感染的重要手段，但由于PCR对实验设备以及实验操作要求较高，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。为此，有必要建立一种能快速检测临床标本中Mp抗原的方法。本实验应用Mp单抗初步建立了以检测Mp抗原为目的的双抗体ELISA夹心法。并通过了PCR技术对照，检测了Mp标准菌株及部分临床标本，对该方法的临床应用价值进行了探讨。
1 资料与方法
1.1 抗原制备
Mp标准株FH(购于首都儿科研究所)，于SP.4培养基(购于生物梅里埃公司)培养5d，培养基颜色由红变黄后，以12000r·min-1 离心1h，用PBS洗涤3次，收集菌体后冰浴超声裂解，制成Mp抗原液。
1.2 纯化Mp单抗
Mp单抗由本室制备，将2株针对不同抗原决定簇的Mp单抗5B9、4D6杂交瘤腹水提取液，按硫酸铵盐析法和DEAE Sephadex G50柱层析，5mmol·L-1 pH7.0的PBS洗脱，收集单抗，用紫外吸收法测定纯化后2株单抗的A260 、A280 ，计算蛋白含量，用免疫荧光法(IFA)测定抗体的效价。
1.3 酶结合物制备
使用辣根过氧化物酶(HRP)，采用过碘酸钠法标记Mp单抗(4D6)，按文献[1]进行操作。
1.4 包被抗体和酶标记物的工作浓度
采用方阵滴定法，将5B9单抗按不同稀释度包被酶标板，4℃过夜，次日用2%的酪蛋白37℃封闭2h，PBS.T洗涤3次，加制备好的Mp抗原，37℃作用30min，再洗涤3次，然后加不同稀释度的酶标抗体，37℃作用30min，洗涤后TMB底物显色，以PBS液作阴性对照，酶标仪450nm测定A值，计算阳性对照与阴性对照的比值(简称P.N值)，确定包被抗体和酶标抗体的最适工作浓度。
1.5 敏感性和特异性的检测
将上述已制备好的Mp抗原(0.7g·L -1 )用PBS稀释成不同浓度，包被抗体和酶标抗体采用最佳工作浓度，观察双抗体夹心ELISA法和PCR法在不同Mp-Ag 浓度的反应结果，用溶脲脲原体、口腔支原体、猪鼻支原体、精氨酸支原体、莱氏胆甾支原体、鸡毒支原体、鸡滑膜囊支原体及生殖支原体进行Mp单抗特异性检测。
1.6 PCR检测
参照文献[2]方法，以16srRNA为靶基因的引物(中国科学院上海生物工程技术服务有限公司合成)，上游引物为5′.TTA GCA GGT GGC TAG AG.3′;下游引物为5′.CTC GGT TAA CCT CAA TTA TG.3′，50μl反应体系，模板5μl，上下引物各5μmmol，dNTP2μl，10倍浓度的反应缓冲液5μl，Taq酶1μl，超纯水补足50μl，反应温度94℃作用2min，55℃1min，72℃2min，共25个循环，循环结束后72℃再延伸10min。扩增产物在1%琼脂糖凝胶(含1mg·L-1 溴化乙锭)电泳，紫外线灯上观察结果。
1.7 临床标本检测
147份临床标本来源于我院和上海市儿科医院疑诊肺炎患者咽拭子，生理盐水洗涤，一部分裂解后，15000r·min-1 离心50min，上清液作双抗体夹心ELISA试验;一部分直接煮沸20min，冰浴10min，12000r·min -1 离心5min，上清液作PCR试验。
2 结果
2.1 Mp单抗纯化后的蛋白含量及效价见表1。
表1 纯化后2株Mp单抗(5B9、4D6)蛋白含量及效价(略)
2.2 包被抗体与酶结合物工作浓度的选择见表2。
表2 不同浓度包被单抗的反应结果(略)
注:上表结果为酶标单抗(4D6)，稀释度为1∶200
固定包被单抗5B9的浓度(10mg·L -1 )，酶结合物1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀释，酶结合物为1∶200时，阴性对照A450 值较低，阳性对照与阴性对照A450 之比(P.N值)较高。故采用酶结合物稀释度为1∶200。固定酶结合物的浓度(1∶200)，稀释包被抗体的浓度，寻找包被单抗的最适浓度。从表2中可以看出，包被5B9单抗10μg·ml-1 以上P.N>2.1，得到阳性结果，包被单抗20mg·L-1 时P.N值更为合适，故采用20mg·L-1 Mp单抗包被。
2.3 敏感度试验见表3。
表3 不同浓度Mp抗原ELISA的反应结果(略)
酶结合单抗(4D6)稀释度为1∶200，包被单抗5B9浓度为20mg·L -1 ，稀释Mp抗原，得本方法的敏感度。从表3中可以看出，当Mp抗原为2mg·L -1 时P.N值>2.1，故建立ELISA双抗体夹心法敏感度为2mg·L-1 。
2.4 特异度试验
以新建立的ELISA方法进行溶脲脲原体、口腔支原体、猪鼻支原体、人型支原体、莱氏胆甾支原体、鸡毒支原体、鸡滑膜囊支原体及生殖支原体与Mp单抗特异性检测，没有发现交叉反应。
2.5 临床标本检测结果
见表4。
表4 临床标本的检测结果(略)
以PCR法作为参照，对147例临床咽拭子标本进行检测，PCR阳性率为13.6%(20.147)，ELISA为 12.2%(18.147)，两方法的吻合率为95.9%(141.147)，经χ 2 检验，两方法的检测结果无显著性差异(χ 2 =0.667，P>0.05)。
3 讨论
肺炎支原体分离培养难度大，给实验研究和临床检测造成很大困难，客观上需要一种灵敏度高、特异性强且简便易行的Mp抗原检测方法供实验室及临床使用。
建立检测肺炎支原体抗原方法的关键是要具备一种特异性好、效价高的肺炎支原体抗体。使用多克隆抗体检测Mp抗原，往往特异性不高，交叉反应严重。使用单抗检测Mp抗原则敏感性强，特异性高[3] 。我们应用Mp单抗建立的检测Mp抗原双抗体夹心ELISA法，灵敏度高(最低检测浓度为2μg·ml -1 )、特异性强，与种属相近的支原体没有交叉反应，很好地解决了多克隆抗体存在的血清学交叉问题。我们对147份临床标本进行了Mp抗原的检测，同时用PCR方法作平行测定，结果两种方法的检测结果无显著性差异(P>0.05)，符合率达95.9%。
文献报道[4] ，使用同一株杂交瘤分泌的单抗将会降低单抗对Mp抗原的捕获率，因此，本次试验包被单抗为5B9株，按20μg·ml-1 的工作浓度，酶标单抗用另一株杂交瘤分泌的抗体(4D6)，同时对ELISA法的试验条件进行了优化选择，获得了较满意的结果。该方法具有高灵敏、高特异检测Mp抗原的特性，为临床肺炎支原体的快速检测打下了基础。
[参考文献]
[1]CIMOLAI N，BRYANL E.To-metal，immunological cross-reactivity of a Mycoplasma pneumoniae membrane-associated protein antigen with Mycoplasma genitalium and Acholeplasma laidlawii[J].J Clin Microbiol，1987，25(11):2136.2139.
[2]曹玉璞，叶元康.支原体与支原体病[M].北京:人民卫生出版社，2000.305.306.
[3]HIRSCHBERG L，HOLME T.ELISA for detection of Mycoplasma pneumoniae antigens using monoclonal antibodies[J].APMIS，1991，99(5):475.481.
[4]刘春霞，辛颜彬，杨雪芬，等.双抗体夹心ELISA检测生殖支原体抗原方法的初步建立及临床应用[J].军事医学院院刊，2002，26(2):127.129.
[基金项目] 上海市卫生局课题[S99(14)]
[作者简介] 涂少华(1967-)，男，江西九江人，主管技师，医学硕士。
(同济大学附属同济医院检验科，上海 200065)
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