川芎嗪对哮喘大鼠肺组织ＣＤ44干预机制的实验研究
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[摘要]目的 探讨川芎嗪对不同时段哮喘大鼠肺组织CD44的作用机制。 方法 以卵蛋白致敏制备大鼠哮喘模型，采用腹腔注射不同剂量川芎嗪、地塞米松或川芎嗪+地塞米松(联合用药)进行干预，分别在激发或干预后的1、2周取肺组织，用逆转录聚合酶链反应(RT.PCR)和免疫组织化学SP方法研究肺组织CD44的表达。 结果 正常大鼠肺组织CD44有少量表达。与正常对照组比较，在激发哮喘后1周肺组织中CD44的表达显著升高(P<0.05)，2周后升高更加明显(P<0.001)。各用药干预组CD44的表达均高于正常对照组但低于哮喘模型组，且随着干预时间的延长，降低幅度增大;川芎嗪大剂量干预组与地塞米松组相似，干预至两周时接近正常水平，二者降低的幅度均大于川芎嗪小剂量干预组和联合用药组;川芎嗪小剂量干预组和联合用药组间无明显差异(P>0.05)。 结论 哮喘肺组织CD44过量表达与哮喘的发生发展密切相关，并在早期即开始参与哮喘的发病。川芎嗪可通过抑制肺组织CD44在转录和蛋白水平的过度表达而阻止哮喘的发展。
[关键词] 哮喘;CD44;川芎嗪;大鼠
粘附分子CD44通过刺激多种细胞增殖和基质合成、增高气道反应性、促进炎性细胞聚集和气道重塑等多个环节参与哮喘的发病，但随着哮喘的进展CD44如何变化及川芎嗪对其有何影响，国内外未见详尽报道。本研究观察了不同时段哮喘大鼠模型肺组织中CD44在mRNA和蛋白水平的表达及川芎嗪的影响，旨在进一步阐明CD44在哮喘时的变化和川芎嗪的干预机制，为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
动物:健康雄性SD大鼠96只，体重220～250g(上海中国科学院实验动物中心提供)。
主要试剂及药品:鸡卵清蛋白(ovalbulium，OVA，Sigma公司)，高温灭活百日咳杆菌(上海生物研究所)，Tripure试剂(Roche公司)，焦磷酸二乙酯(南京创瑞生物技术有限公司)，CD44与GAPDH引物由上海生工生物工程技术公司合成，逆转录聚合酶反应(RT.PCR)试剂盒(大连宝生物公司，Takara)，兔抗大鼠CD44抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，SP免疫组织化学、DAB显色试剂盒(北京中衫金桥生物技术有限公司)，川芎嗪注射液(天津金耀制药厂)，地塞米松注射液(南京第二制药厂)。
1.2 方法
1.2.1 大鼠哮喘模型制备 参照文献[1]制备。
1.2.2 实验分组 96只大鼠分为6组，即正常对照组、哮喘模型组、川芎嗪大剂量干预组、川芎嗪小剂量干预组、地塞米松组和川芎嗪+地塞米松组(联合用药组)，每组16只。除正常对照组外，各组以OVA腹腔注射致敏2周后，将大鼠置于透明密闭容器，给予1%OVA雾化吸入激发哮喘，中等雾量，每次20min。哮喘模型组激发前以生理盐水腹腔注射;药物干预大鼠每次激发前30min分别给予川芎嗪(大剂量80mg·kg-1 或小剂量40mg·kg
-1 )、地塞米松(0.5mg·kg-1 )及联合用药(川芎嗪40mg·kg-1 +地塞米松0.25mg·kg-1 )腹腔注射。正常对照组在第0天腹腔注射0.9%生理盐水2ml，两周后用生理盐水雾化吸入，余同哮喘模型组。以上各组动物均于激发或干预后1、2周最后1次激发24h内随机各处死8只，收集肺组织。
1.2.3 标本制备
开胸取右肺中叶80mg置入无RNA酶EP管，置-70℃冰箱，1个月内行总RNA抽提。其余肺叶用10%中性福尔马林固定，行HE染色和免疫组织化学检测。
1.2.4 CD44mRNA的检测
(1)肺组织总RNA提取与定量:采用Tripure-氯仿一步法提取80mg大鼠肺组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA含量。(2)RT.PCR:根据试剂盒说明逐一加入试剂及1μg总RNA，反应体积50μl。先逆转录合成cDNA，再行PCR扩增。采用目的基因与管家基因磷酸.3.甘油醛脱氢酶(GAP-DH)两对引物在同一反应体系中进行PCR:94℃2min预变性一次循环;94℃30s，58℃30s，72℃4min，共30个循环;最后以72℃延伸10min。CD44和GAPDH的引物如表1。(3)CD44mRNA的半定量检测:取CD44与GAPDH扩增产物5μl在2%琼脂糖凝胶中，80V电压电泳50min，以DNA Marker DL2000同时电泳作为DNA片段分子质量标准，推测PCR扩增产物正确与否。用Image Kaster Total Lab分析软件以GAPDH为内参照分别计算产物CD44的相对表达量。表1 PCR引物的碱基序列及扩增片段长度目的基因 引物序列(略)
1.2.5 CD44免疫组织化学半定量分析
采用免疫组化SP法。PBS代替一抗作阴性对照。石蜡切片常规脱蜡至水，过氧化氢甲醇液灭活内源性过氧化物酶，采用复合消化液消化处理抗原修复，滴加正常山羊封闭液，室温孵育15min，各组分别滴加1∶100的第一抗体(CD44)，37℃孵育2h，PBS洗净后，滴加生物素标记二抗，37℃反应15min，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃反应15min，PBS洗5min，共4次。DAB室温下显色，镜下控制反应时间(10min)，常规洗净，苏木素复染，封片观察。采用HMIAS.2000高清晰度彩色医学图文分析系统测定各组气道粘膜CD44含量(以静态灰度值表示，由南京军区总医院病理科提供)。
1.3 统计学处理
所有数据结果以ˉx±s表示，采用SPSS11.5统计软件处理数据，两组间采用t检验，多组间采用单因素方差分析。P<0.05时表示差异有显著性。
2 结 果
2.1 哮喘模型的鉴定
根据激发反应、肺组织HE染色确定模型建立成功。
2.2 各组肺组织CD44mRNA的表达
见表2。
表2 各组不同时期肺组织CD44mRNA的表达(略)
激发或药物干预1周时，与正常对照组比较，哮喘模型组肺组织CD44mRNA的表达显著升高(P<0.05)，各药物干预组中的含量均高于正常对照组，但低于哮喘模型组(P<0.05)，4个药物干预组间无显著性差异(P>0.05)。激发或干预至2周时，与正常对照组和1周时比较，哮喘模型组肺组织CD44mRNA的表达升高更加明显(P<0.001)，各药物干预组与其1周时和哮喘模型组比较明显降低但仍高于正常对照组(均P<0.05)，川芎嗪大剂量干预组和地塞米松组间CD44含量无统计学差异，但二者均明显低于川芎嗪小剂量干预组和联合用药组(P<0.05)，川芎嗪小剂量干预组和联合用药组间无显著性差异(P>0.05)。
2.3 气道壁CD44免疫组织化学表达改变见表3。
表3 各组不同时期肺组织CD44DAB染色半定量分析结果(略)
气道壁CD44主要表达在气道粘膜上皮细胞胞膜，胞浆中无表达，炎性细胞、肺血管内皮细胞、基底膜、支气管平滑肌未见表达。图像分析结果显示，CD44在正常对照组气道壁弱阳性表达，激发或干预1周时，在哮喘模型组气道粘膜上皮稳定阳性表达，在川芎嗪小剂量干预组其表达低于哮喘模型组但无显著性差异(P>0.05)，与正常对照组、川芎嗪大剂量干预组、激素干预组比较均偏高(P>0.05);激素干预组明显较哮喘模型组低(P<0.05)，川芎嗪大剂量干预组高于地塞米松干预组但低于联合用药组(P<0.05)。激发或干预至2周时，哮喘模型组气道粘膜上皮CD44呈强阳性表达;川芎嗪大剂量干预组CD44表达与地塞米松干预组相近(P>0.05)，较哮喘模型组降低更为明显，降低程度大于川芎嗪小剂量干预组和联合用药组;川芎嗪大剂量干预组CD44表达略高于正常对照组但无显著性差异(均P>0.05);川芎嗪小剂量干预组与联合用药组间比较无统计学差异，但二者均低于哮喘模型组高于正常对照组(P<0.05)。
3 讨 论
在哮喘气道一系列慢性炎症过程中，炎性细胞粘附到气道内皮是关键步骤。研究发现，细胞粘附分子中糖蛋白及其粘附机制可能是介导和参与哮喘时细胞浸润、增殖乃至间质纤维化的分子基础。
CD44是细胞粘附分子中的重要成员，在正常肺组织少量表达，有促进组织修复、维持正常组织结构的作用。哮喘时上皮进入修复表型是对溶蛋白性侵袭的反应形式，其标志之一为CD44的过度表达[2] 。CD44主要通过介导细胞与细胞、细胞与基质之间的特异性粘连、刺激多种细胞增殖和基质的合成、参与并介导多种炎症细胞的粘附和跨内皮转移，尤其在促使嗜酸粒细胞和淋巴细胞聚集于肺部发挥重要作用[3] 。CD44可吸引化学趋化因子在细胞局部粘附，从而导致炎症细胞在局部聚集，并通过炎症细胞的破坏和分解导致局部损伤，进而导致上皮和基底的破坏和萎缩，直至纤维化形成[4] 。因此，探讨如何阻断哮喘炎症中CD44的过度表达，对防止哮喘的发生发展具有重要意义。
本研究利用RT.PCR显示，CD44在正常大鼠肺组织少量表达，激发哮喘后肺组织CD44表达明显上调，随着激发时间的延长升高更加明显。免疫组织化学检测结果证实，CD44主要表达在气道粘膜上皮细胞膜，同时表明哮喘模型组不论在代表大气道的段支气管或细支气管肺泡区，CD44的蛋白表达均较正常对照组显著升高，且随着哮喘持续时间的延长，肺组织CD44的表达亦随之增高，提示CD44与哮喘病变程度有关，在疾病早期即发挥重要作用，这种作用随着哮喘的进展而增强。有研究[5] 发现，许多细胞如血管平滑肌细胞、内皮细胞损伤激活后CD44及其mRNA可迅速表达，其表达水平与细胞损伤激活程度有关。Katoh等[6] 报道，CD44单克隆抗体可通过减少CD44的产生抑制嗜酸粒细胞从外周血渗入呼吸道、抑制嗜酸粒细胞和淋巴细胞向肺部炎症组织趋化浸润。因此，在病理状态下，通过药物抑制CD44的表达是抑制细胞粘附和炎 症反应的重要途径，有利于在早期控制哮喘的发展。
川芎嗪是从川芎中分离提纯的一种生物碱单体，主要成分是四甲基吡嗪，具有行气、活血、化瘀等功效。国内已有人试用于哮喘治疗的临床观察，但其作用机制报道甚少。本实验首次从基因转录和蛋白水平探讨川芎嗪对哮喘模型粘附分子CD44的干预机制，为进一步的临床应用提供实验依据。本实验中发现，川芎嗪干预组气道壁粘膜上皮细胞CD44的表达较哮喘模型组明显减弱，且大剂量优于小剂量和联合用药。随着干预时间的延长，大剂量干预组CD44的表达接近正常对照组，与地塞米松组相似，提示川芎嗪对哮喘肺组织CD44的表达有良好的抑制作用，且有时间和剂量依赖性，对CD44的干预效果等同糖皮质激素但无激素的副作用。这可能与川芎嗪能抑制血小板凝集、降低血液粘度、改善血流动力学有关，改善了气道周围组织的血液瘀滞状态，血流畅通，使局部组织的理化环境恢复正常，从而阻断了哮喘病理发生过程中的微循环障碍。本实验中还发现，川芎嗪小剂量干预组CD44的表达在早期出现转录与蛋白水平的不一致性，提示小剂量用药起效慢且早期疗效不稳定，至于用何种剂量及干预多长时间更加合理尚需进一步的实验求证。
已知转化生长因子.β(transforming growth factor.β，TGF.β)是哮喘气道重建的主要调控因子，促进细胞外基质的异常聚集，CD44可通过介导单核巨噬细胞分泌大量TGF.β[7] 。本课题组已证实，川芎嗪可通过减少气道壁TGF.β1 的表达而抑制气道重建[8] 。因此，我们认为减少粘附分子CD44的表达可能是川芎嗪发挥抑制气道重建作用的途径之一。
尽管激素是目前最有效的平喘药物，但有关长期吸入激素的毒副作用及其是否影响哮喘儿童的生长发育等问题还存在争议，且激素在临床应用中也不尽如人意。而川芎嗪为纯中药制剂，安全、毒副作用小，值得进一步临床研究。
[参考文献]
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[8]王文建，杨莉，李海浪，等.川芎嗪对哮喘大鼠气道壁平滑肌增殖及TGF.β1 表达的影响[J].东南大学学报(医学版)，2003，22:387.390.
(东南大学附属中大医院儿科，江苏南京 210009)
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