兔成骨细胞与骨髓基质干细胞混合培养的实验研究
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参见附件(367KB，5页)。
[摘要]目的 探讨成骨细胞、骨髓基质干细胞混合培养时，细胞增殖及成骨能力的改变，为骨组织工程寻找一种新的种子细胞获取方法。 方法 实验组:取第3代成骨细胞与第3代骨髓基质干细胞以1∶1比例直接混合培养，一定时间后测定细胞的增殖及成骨情况。对照组:分别取上述两种细胞在与混合培养细胞完全相同的条件下单独进行培养，按测定混合培养细胞相同的方法分别测定该两种细胞的相应指标。将混合培养细胞与同期两种对照细胞相应指标的平均值进行比较。 结果 在细胞增殖和细胞成骨能力等方面均是实验组明显高于相应的平均值。 结论 将第3代成骨细胞与骨髓基质干细胞混合培养，可以使其中一种或两种细胞增殖加快，成骨能力加强。该方法可能成为一种新的骨组织工程种子细胞的获取方法。
[关键词] 成骨细胞;骨髓基质干细胞;混合培养;兔
The research on cocultivation of osteoblast and marrow stromal cell
CAI Guo-feng，ZHANG Qing-guo ，HUANG Kai
(1.Department of Orthopedics，the First People's Hospital of Kunming，Kunming650011，China;2.Department of Plastic Surgery，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China;3.The Second People's Hospital of Changshu，Changshu215500，China)
Abstract:Objective To investigate the proliferation and osteogenesis ability change of osteoblasts and bone marrow stromal cells when cocultureing and thus try to find a newway to supply seed cells for bone tissue engineer-ing.Methods Experimental group:passage3osteoblasts derived from the skull of fetal rabbitwere cocultured with passage3marrow stromal cells from the mother rabbit at ratio of1∶1.Control groups:these two kinds of cells were cultured respectively under the same condition and with the same cell density as the experimental group.After cer-tain time of cultivation，number of cells，alkaline phosphatase(ALP)in the culture medium，number of calcifica-tion nodules formed by cells in certain area were detected.The values of the experimental group was compared with the corresponding values of the control groups(“average value”).Results Both the indexes of cells'proliferation and cells'competence of forming bone of the experimental group were higher than the“average value”.Conclusion Because osteoblasts and marrow stromal cells were cocultured at ratio of1∶1and at the beginning of cultivation the control groups and the experimental group had same number of cells，if the osteoblasts and the marrow stromal cells had no effect on each other，there should be no statistic difference between these two series of values.Accord-ing to the results，we conclude that by coculturing passage3osteoblasts and passage marrow stromal cells，one or two kinds of these cells can proliferate faster and enhance the osteogenetic ability.This cocultivation method may become a new one to supply seed cells for bone tissue engineering.
Key words:osteoblasts;bone marrow stromal cells;coculture;rabbit
对骨髓基质干细胞进行改造，使其在保持快速生长的同时向成骨细胞方向分化是目前国内外研究的热点。实验发现，成熟的成骨细胞可以通过细胞间的直接接触作用促进骨髓基质干细胞增殖[1] ，此外成骨细胞可产生多种生长因子促进其骨髓基质干细胞的增殖、分化[2] 。由于骨髓基质干细胞通过诱导向成骨细胞分化后，难以再与原有的成骨细胞区分开，因此，本实验将骨髓基质干细胞与成骨细胞以1∶1的比例直接混合培养，同时将成骨细胞和骨髓基质干细胞在与混合培养细胞完全相同的条件下单独进行培养并取其平均值作为对照，以细胞计数、细胞碱性磷酸酶(ALP)染色阳性率、细胞培养液上清中碱性磷酸酶含量、细胞形成钙结节数目为观察指标，将混合培养细胞与相应成骨细胞及骨髓基质干细胞指标的平均值进行比较，观察两者的区别。
1 材料与方法
1.1 材料
无酚红DMEM培养液(Hyclon公司)、胎牛血清(杭州四季清公司)、淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)、碱性磷酸酶染色液及测试盒(南京建成生物工程研究所)。
1.2 方法
1.2.1 成骨细胞分离培养及鉴定
1.2.1.1 成骨细胞分离、培养 孕28d青紫兰兔
[南京安立默科技有限公司提供，合格证号scxk(苏)2002-0002]，按1ml·kg-1 的3%戊巴比妥钠静脉麻醉成功后，行剖宫产手术，取出胎兔，术毕注意保持母兔成活。采用酶消化法自胎兔颅骨分离出成骨细胞，用含20%胎牛血清的DMEM培养液进行培养。消化剩余的骨组织块采用贴块法培养。
1.2.1.2 成骨细胞鉴定
采用细胞形态学观察、绘制细胞生长曲线[3] 、细胞碱性磷酸酶染色、原代细胞汇合后继续不传代培养14d可否形成钙结节等4项内容进行成骨细胞鉴定。
1.2.2 骨髓基质干细胞分离培养及鉴定[4]
对经淋巴细胞液分离的母兔骨髓液中的骨髓基质干细胞，用含20%胎牛血清的DMEM培养液培养。按与成骨细胞鉴定相同的方法完成对骨髓基质干细胞的 鉴定。
1.2.3 成骨细胞与骨髓基质干细胞混合培养
取生长良好的第3代骨髓基质干细胞与第3代成骨细胞进行混合培养，培养条件同单独培养。观测指标及平均值计算方法如下。
1.2.3.1 细胞计数
取相同数量的成骨细胞与骨髓基质干细胞充分混匀后以5×104 个·孔-1 的密度种植于24孔细胞培养板中培养，共种植48孔，每隔24h用胰蛋白酶消化6孔，计数细胞数量。各取成骨细胞与骨髓基质干细胞以5×104 个·孔-1 的密度种植于24孔细胞培养板中培养作为对照，两种细胞各种48孔，每隔24h用胰蛋白酶消化6孔，计数细胞数量。
1.2.3.2 培养液上清中碱性磷酸酶含量测定
取相同数量的成骨细胞与骨髓基质干细胞充分混匀后按2×105 个·瓶-1 的细胞密度接种于50ml细胞培养瓶中进行培养，共接种12瓶。培养开始后3、6、9d分别采用试剂盒测定细胞培养液上清中碱性磷酸酶含量。各取成骨细胞及骨髓基质干细胞与混合培养细胞完全相同的条件单独进行培养。采用与上述相同的方法测定相应指标。注意在接种时预先在培养瓶中置入长条形玻片，使成骨细胞组、骨髓基质干细胞组、混合培养细胞组各6瓶细胞中置有1块玻片。
1.2.3.3 培养至第7天时细胞碱性磷酸酶染色阳性率测定
培养至第7天时细胞爬满上述放置于培养瓶中的玻片，将玻片取出，行碱性磷酸酶染色，3种细胞均各计数6块玻片，共600个细胞(每块均计数四角及中央共5个部位100个细胞)。按公式:细胞碱性磷酸酶染色阳性率=染色阳性细胞数/600，分别计算出成骨细胞、骨髓基质干细胞、混合培养细胞染色阳性率。
1.2.3.4 单位面积细胞形成钙结节计数
将未放入玻片的细胞继续进行不传代培养，至21d时行von kos-sa染色，计数瓶壁四角及中央4处共8个0.5cm×0.5cm小方格内细胞形成的钙结节数目，按公式:钙结节数=细胞在8个小方格内形成的钙结节总数/8，求出成骨细胞、骨髓基质干细胞、混合培养细胞形成的平均钙结节数量。
1.2.3.5 平均值的计算
除细胞碱性磷酸酶染色阳性率为两种细胞计数总数(染色阳性成骨细胞数+染色阳性骨髓基质干细胞数)外，其余各指标的平均值计算公式均为(成骨细胞+骨髓基质干细胞)/2。
1.2.4 统计学处理
计量指标的比较采用Prism软件系统进行分析，率的比较行χ2 检验。
2 结果
2.1 成骨细胞鉴定
2.1.1 形态学观察
骨组织植块在培养24h后，即可见少量细胞从植块边缘爬出，培养2周左右，相邻植块爬出的细胞可以汇合;而分离出的成骨细胞在培养24h后，细胞贴壁生长呈长梭形、不规则形，培养10d左右细胞基本长满培养瓶壁，细胞相互汇合后呈明显“铺路石”状(图1)。
传代培养的细胞生长较快，一般接种2h即已贴壁，培养4～5d细胞即可长满瓶壁，细胞形态与原代相同。
2.1.2 生长曲线
第1代成骨细胞生长曲线如图2所示。
2.1.3 碱性磷酸酶染色
第1代成骨细胞经碱性磷酸酶染色后阳性率可达到90%以上(图3)。
2.1.4 钙结节形成及观察
成骨细胞连续培养至14d时，在培养瓶壁上可见到棕褐色有层次感的钙结节，经von kossa染色呈黑色(图4)。
2.2 骨髓基质干细胞鉴定
2.2.1 形态学观察
原代细胞于接种48～72h后开始贴壁，贴壁后细胞成三角形、纺锤形;细胞汇合后，呈条索状、辐射状;培养1周左右细胞长满培养瓶壁。传代培养的细胞生长加快，一般接种2h即可贴壁，3d可长满瓶壁，细胞形态与原代相同。
图4 培养至14d时成骨细胞形成的钙结节
von kossa×100
2.2.2 生长曲线
第一代骨髓基质干细胞生长曲线如图5所示。
2.2.3 碱性磷酸酶染色
第1代骨髓基质干细胞经碱性磷酸酶染色后多数呈阴性，染色阳性率约为5%，见图6。
2.2.4 钙结节观察
培养至14d时，培养瓶壁上可见大量细胞堆积，但未见棕褐色钙结节形成，经染色后亦未见到染成黑色的钙结节。
2.3 成骨细胞与骨髓基质干细胞混合培养
2.3.1 细胞计数
培养开始后8d内混合培养细胞数均高于平均值(P<0.05)，见表1。
表1 培养开始8d内各天细胞计数(略)
2.3.2 培养液上清中碱性磷酸酶含量测定
培养第3、6、9天混合培养细胞培养液上清中碱性磷酸酶含量均分别高于相应平均值(P<0.05)，见表2。
表2 培养液上清中碱性磷酸酶含量(略)
2.3.3 培养至第7天时细胞碱性磷酸酶染色阳性率测定
培养至第7天时混合培养细胞碱性磷酸酶染色阳性率为72%，明显高于平均值52%(P<0.05)，见图7。
2.3.4 单位面积细胞钙结节形成及计数
培养至21d时，混合培养细胞在0.5cm×0.5cm面积内形成的钙结节数目为(15.60±2.87)个，明显高于平均值(9.33±1.03)个，两者比较P<0.05。
3 讨 论
3.1 骨髓基质干细胞
目前获取骨髓基质干细胞的方法主要包括梯度离心法、骨髓液稀释后直接接种法等，本实验中采用梯度离心法，我们认为该方法具有简单易行、快速等优点。骨髓基质干细胞可向成骨细胞转化，碱性磷酸酶是这一过程的标志性酶之一[5] ，目前普遍认为碱性磷酸酶在体外钙化中起着关键性作用，即若没有碱性磷酸酶活性，钙化就不会发生[6] 。其主要机制在于碱性磷酸酶能够水解有机磷酸酶使局部PO4+ 浓度升高，并可破坏钙化抑制剂，从而启动钙化。在细胞内碱性磷酸酶升高的同时，细胞分泌也相应增多，故通过定量测定细胞培养液中碱性磷酸酶的含量及细胞染色的阳性率可反映骨髓基质干细胞转化程度。
3.2 成骨细胞
目前提取成骨细胞的主要来源是骨膜和松质骨，培养方法有酶消化法和组织贴块法。本实验中采用胎兔颅骨胶原酶消化法进行成骨细胞提取，消化剩余的骨组织再采取贴块法培养，使胎兔颅骨得到了充分利用。成骨细胞具有分泌作用，可分泌骨形成蛋白(BMP)[7] 、碱性成纤维细胞生长因子(b.FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)[8] 、胰岛素样生长因子(IGF)[9] 等，而目前生长因子对骨髓基质干细胞的诱导作用已有定论，采用成骨细胞的培养液提取物促进骨髓基质干细胞的增殖、分化也有文献报道。
3.3 骨髓基质干细胞与成骨细胞混合培养的意义
骨髓基质干细胞的多向分化潜能是其成为理想的 骨组织工程种子细胞的最大障碍。在将骨髓基质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的问题上，现有的几种方法均存在不足之处:常规诱导液导致细胞生长减慢;使用生长因子尚处于摸索阶段，且生长因子昂贵的价格也限制了它的广泛使用。因此有必要寻找一种新的诱导方法。
从本实验结果来看，在各时间点上，均是混合培养细胞在细胞增殖、细胞成骨能力上明显优于平均值。尽管混合培养细胞的细胞数量这一反映细胞增殖能力的指标尚低于骨髓基质干细胞，但与平均值相比仍反映出混合培养细胞的增殖能力、成骨能力较强。骨髓基质干细胞的定向诱导分化是目前研究的热点，尚无一种公认的最佳方法，采用将成骨细胞与骨髓基质干细胞直接混合培养的方法目前尚无文献报道，本实验结果初步证实了该方法的有效性，该方法可能成为一种新的骨组织工程种子细胞获取方法。
[参考文献]
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[9]BAYLINK D J，FINKELMAN R D，MOHAN S.Growth factors to stimulate bone formation[J].J Bone Miner Res，1993，8:S565. 572.
(1.昆明市第一人民医院骨科，云南昆明 650011;2.东南大学附属中大医院整形外科，江苏南京 210009;3.常熟市第二人民医院，江苏常熟 215500)
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