肺癌患者细胞角蛋白19ｍＲＮＡ的表达及其临床意义
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[摘要]目的 探讨细胞角蛋白19(CK19)mRNA在肺癌患者外周血中的表达及其临床价值。 方法 采用半定量逆转录多聚酶链反应(RT.PCR)法测定40例肺癌、10例肺良性病变、10例健康对照者外周血CK19mRNA的表达。 结果 肺癌患者CK19mRNA阳性率为47.5%(19.40)，明显高于肺良性病变组(P<0.05)和健康对照组(P<0.01)，且与临床分期有关，与肿瘤病理类型无关。 结论 肺癌患者外周血CK19mRNA检测对肺癌的早期诊断、预后评估有意义。
[关键词] 肺肿瘤;细胞角蛋白19;逆转录多聚酶链反应
肺癌是危及人类健康的主要疾病之一，且发病率逐渐上升，已占男性肿瘤患者死亡率的第一位，女性肿瘤患者死亡率的第二位。尽管近年来医学发展迅速，但因早期诊断比较困难，且临床治疗手段尚有限，患者5年生存率较低(10%)。因此，寻找敏感特异的早期诊断指标有着重要的临床价值，其中细胞角蛋白(CK)是近年来研究较多的一类肿瘤标志物。随着分子生物学的发展，逆转录聚合酶链反应(RT.PCR)应用于扩增组织特异性mRNA，其敏感性高、特异性强。本研究采用RT.PCR法检测肺癌患者外周血中CK19mRNA的表达并探讨其临床意义。
1 资料和方法
1.1 研究对象
肺癌组:收集手术切除或经纤维支气管镜活检病理证实的40例肺癌患者，其中男24例，女16例，年龄32～77岁;Ⅰ期6例，Ⅱ期11例，Ⅲ期13例，Ⅳ期10例;鳞癌16例，腺癌14例，小细胞癌9例，腺鳞癌1例。肺部良性病变组10例，其中炎症7例，结核3例。健康对照组10例。
1.2 标本采集
抽取所有研究对象静脉血各5ml，用肝素抗凝、淋巴细胞分离液进行有核细胞分离。
1.3 总RNA的抽提、定量及逆转录合成cDNA
使用上海生工公司提供的经典总RNA抽提试剂盒(SK1352):主要成分为变性液、β.巯基乙醇、醋酸钠、异丙醇、水饱和酚、Chloroform.Isoamylaclcohol，所得样品
用50ml的DEPC.H2 O溶解沉淀备用，并测定样品在260nm和280nm的吸光度确定RNA的质量，以A260 .A280 的值判定纯度及A260 值计算RNA浓度，进行甲酰胺变性琼脂糖电泳确定抽提RNA的完整性。
使用MMLV第一链cDNA合成试剂盒(SK2028)，终止反应后放入-80℃冰箱中保存备用。反应体系中含有:5×Reaction Buffer，dNTP Mix，Oligo.p(dT)18Primer，Random Primer p(dN)6，RNase Inhibitor。
1.4 PCR扩增及电泳结果测定
根据cytokeratin19cDNA序列(BC007628)设计其引物及β.actin内参照引物一对，由上海生工公司合成，分别为5′.TCG CCA AGA TCC TGA GTG A.3′，5′.TCC GTTTCT GCC AGT GTG T.3′;5′.AGC GGG AAA TCG TGC GTG.3′，5′.CAG GGTACATGGTGGTGCC.3′。PCR使用扩增试剂盒(SK2492)，20μl PCR反应体系包含cDNA1.6μl，dNTP(2mmol·L-1 )2μl，正、反义引物各6pmol，Taq酶0.5U，10×PCR Buffer2μl，MgCl2 (25mol·L-1 )2μl，反应条件94℃预变性10min，94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s计30个循环，后72℃延伸10min，产物经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，通过天能GIS.1000数码凝胶摄影系统对DNA电泳条带分析，将CK19与β.actin比值对CK19PCR产物相对定量。riODck.β.actin=(CK19电泳带平均吸光度×面积).(β.actin电泳带平均吸光度×面积)。
1.5 统计学处理
所得数据采用SAS统计软件作卡方检验和方差分析。
2 结 果
2.1 CK19mRNA的检测结果
CK19mRNA经RT.PCR扩增后产物电泳见图1。40例肺癌中，19例CK19mRNA表达阳性，阳性率为47.5%;10例肺部良性病变中，1例(结核)CK19mRNA为阳性;10例健康对照者均阴性，且肺癌组外周血中CK19mRNA阳性率较肺良性病变组、健康对照组有明显增加，差别有显著性(P<0.05)，见表1。
表1 外周血CK19mRNA的表达(略)
2.2 CK19mRNA的表达与肺癌病理特征的关系
结果显示，外周血CK19mRNA在Ⅰ、Ⅱ期肺癌与Ⅲ、Ⅳ期肺癌中表达阳性率分别为35.3%(6.17)，56.5%(13.23)，差异有显著性(P<0.05)，见表2。且对不同分期的肺癌CK19mRNA表达水平进行方差分析，差异亦有显著性(P<0.01);而外周血CK19mRNA的表达率与临床病理分型无关(P<0.05)，见表3。
表2 外周血CK19mRNA在不同分期肺癌中的表达(略)
表3 外周血CK19mRNA在不同病理类型肺癌中的表达 (略)
3 讨 论
随着肿瘤检测技术的不断发展，肿瘤微转移的检测也日益得到重视，临床上常规检查如CT、MRI、病理检查等很难做到早期发现，微转移可作为一项独立的指标[1] 。微转移的肿瘤细胞常以单个细胞或微小细胞团形式经血液系统、淋巴系统转移至骨髓、淋巴结或其他组织器官，也可直接侵袭周围组织，其中CK这一研究较多的标志物是一类由细胞角蛋白基因编码的水溶性聚合多肽，是上皮细胞在发生、分化、成熟过程中逐渐形成的，正常情况下，在外周血、骨髓、淋巴结无表达或者低表达[2] ，在这些部位的异常表达可提示肿瘤及其微转移的发生。本研究着眼的CK19是CK家族中最小的成员，是相对分子质量为40000的酸性蛋白质，在恶性上皮细胞癌中，激活的蛋白酶加速了细胞的降解，使得大量CK片段释放入血[3] 。应用RT.PCR技术测定CK19对肿瘤的早期诊断、治疗选择、预后评估有重要意义，国外学者应用RT.PCR法检测外周血肿瘤微转移已用于肝细胞癌、膀胱癌及肺癌等 [4～6] 。
本研究结果表明，肺癌患者外周血中CK19mRNA的表达显著高于肺良性病变组及健康对照组，但在不同病理类型中无显著性差异，在Ⅲ、Ⅳ期肺癌中阳性率及表达水平显著高于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05，P<0.01)。由此可见，通过CK19mRNA的表达检测可测出肺癌外周血中的微量循环癌细胞，对肺癌早期诊断、评价预后有着一定价值。但用RT.PCR方法检测CK19基因表达时可能存在假基因等的干扰，临床仍需积累大量病例进一步观察。
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(同济大学附属第十人民医院呼吸内科，上海 200072)
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