青蒿琥酯选择性抗肺腺癌细胞的作用及其机制
 |
| 第1页 |
参见附件(222KB，3页)。
[摘要]目的 研究青蒿琥酯抗肺腺癌细胞的选择性及其作用机制。 方法 利用流式细胞仪检测培养的胚肺成纤维细胞和肺腺癌细胞转铁蛋白受体的表达情况，利用四氮唑蓝比色法观察不同浓度青蒿琥酯对培养的两种细胞在应用或不用全铁转运蛋白预处理情况下48h的生长抑制情况，并以顺铂作为阳性对照。 结果 胚肺成纤维细胞表面转铁蛋白受体荧光强度为0.11±0.04，肺腺癌细胞为0.54±0.06;48h200μg·ml -1 青蒿琥酯对胚肺成纤维细胞的抑制率为(12.56±0.31%)，用全铁转运蛋白处理后抑制率为(13.02±0.69)%;对肺腺癌细胞的抑制率为(74.30±0.32)%，用全铁转运蛋白处理后抑制率为(96.12±0.43)%;10μg·ml -1 顺铂对胚肺成纤维细胞抑制率为(36.50±0.61)%，对肺腺癌细胞抑制率为(92.65±0.56)%。 结论 青蒿琥酯对肺腺癌细胞具有选择性细胞毒作用，这与肺腺癌细胞高表达转铁蛋白受体和对铁离子高需求有关。
[关键词] 全铁转运蛋白;铁离子;青蒿琥酯;肺癌
The possible mechanism of artesunate's selective cytotoxicity toward human lung denocarcinoma cells
MIAO Li-yun，ZHANG Zu-yi
(Department of Respiratory Medicine，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China)
Abstract:Objective To investigate the selective cytotoxicity of artesunate to human lung denocarcinoma cells and its possible mechanism.Methods Flow cytometry was used for the detection of transferring receptor ex-pression on the embryonic lung fibroblast cells and human lung denocarcinoma cells.Pretreat the cells with or with-out holo-transferrin3hours，then use artesunate to interfere their growth.After48hours cultivation，under the help of tetrazolium chromatometry，we calculated the ratio of inhibition and the inhibitory concentration50%(IC 50 )，us-ing cisplatin as the positive drug.Results The transferring receptor's fluorescent intensity of embryonic lung fibro-blast cell was0.11±0.04，human lung adenocarcinoma cell was0.54±0.06;At48h，the inhibitory ratio of200μg·ml -1 artesunate to embryonic lung fibroblast cell was(12.56±0.31)%，while after pretreated with holo-trans-ferri was(13.02±0.69)%;the ratio to human lung adenocarcinoma cell was(74.30±0.32)%，while after pre-treated with holo-transferri was(96.12±0.43)%;10μg·ml -1 cisplatin to embryonic lung fibroblast cell was(36.50±0.61)%，to human lung denocarcinoma cell is(92.65±0.56)%.Conclusion The cytotoxicity of ar-tesunate to human lung adenocarcinoma cell is selective，which is related to the high expression of transferring re- ceptor and large require of ferrous iron.
Key words:holo-transferri;ferrous iron;artesunate;lung cancer
青蒿素(artemisinin)是我国首次从菊科艾属黄花 蒿中分离、鉴定出的抗疟疾药物
[1] 。近年来，国内外学者 [2-3] 均报道青蒿素及其衍生物具有抗肿瘤作用，但对其具体作用机制以及对肿瘤细胞的选择毒性报道较少。为此我们进行研究，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 细胞系和培养条件
人肺腺癌细胞(LTEP.a.1)由东南大学医学院呼吸科实验室提供;胚肺成纤维细胞由东南大学医学院儿科实验室提供。接种于含10%小牛血清的RPMI.1640培养液，置于37℃、体积分数为5%的CO 2 培养箱中培养，2～3d传代1次。
1.2 主要试剂
青蒿琥酯(广西桂林制药二厂，批号为010901)临用前溶于5%的NaHCO 3 溶液中，后用RPMI.1640培养液稀释;全铁转运蛋白(Sigma公司);四氮唑蓝(MTT，Gibco公司);二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，FITC标记的鼠抗人转体蛋白受体单克隆抗体(Diaclone，法国)，顺铂(Cisplatin，连云港豪森制药有限公司)。
1.3 两种细胞转铁蛋白受体表达的检测 将对数生长期的两种细胞接种于24孔板，各3个复孔，分别培养48h收获细胞，用PBS洗涤细胞，按每10μl10 6 个细胞比例加入FITC标记的鼠抗人转铁蛋白受体单抗，常温孵育30min，以流式细胞仪检测两种细胞的平均荧光强度。
1.4 细胞分组
共分5组:(1)空白对照组;(2)全铁转运蛋白(终浓度为100μg·ml -1 )对照组;(3)单纯青蒿琥酯组，干预终浓度 [2] 为200、100、50、25、12.5μg·ml -1 ，对胚肺成纤维细胞干预终浓度为200μg·ml -1 ;(4)全铁转运蛋白加青蒿琥酯组，药物浓度同(2)、(3)组;(5)顺铂对照组，干预终浓度为10μg·ml -1 。1.5 细胞增殖抑制试验 取对数生长期的肺腺癌细胞和胚肺成纤维细胞，计数后接种于96孔培养板，使其终浓度为1×10 5 ml -1 ;培养12h，(1)、(3)、(5)组重新换液加入10%FCS的RPMI.1640;(2)、(4)组分别换液加入含全铁转运蛋白的10%FCS的RPMI.1640，各组继续培养3h，(1)、(2)组换液加入10%FCS的RPMI.1640细胞培养液;(3)、(4)组分别换液加入含上述浓度青蒿琥酯10%FCS的RPMI.1640，(5)组换液加入顺铂。每组细胞每浓度均设5个平行对照孔，继续培养;于48h向每孔细胞加入MTT20μl(5mg·ml -1 )，继续培养4h，弃上 清，加入DMSO150μl，放在平板振荡器上振荡溶解甲 月赞 10min，将培养板置ELSA酶标仪在570nm波长处测每孔的光密度(OD)，并记录。根据OD值计算增值率或抑制率以及利用何尔恩法 [4] 计算半数抑制浓度(IC 50 )。增殖率=实验组OD/对照组OD×100%，抑制率=(1-实验组OD/对照组OD)×100%。1.6 统计方法 数据资料用(ˉx±s)表示，两组间采用t检验进行显著性分析。
2 结 果
2.1 两种细胞表面转铁蛋白受体的表达 胚肺成纤维细胞作为对照的正常细胞，48h转铁蛋白受体的平均荧光强度为0.11±0.04，而肺腺癌细胞为0.54±0.06，两组比较，经t检验P<0.01，差别具有显著性意义。
2.2 全铁转运蛋白对两种细胞增殖的影响 全铁转运蛋白是血清中的转铁蛋白经铁饱和处理后的产物，为铁离子进入细胞的载体，其进入细胞是通过转铁蛋白受体介导实现的。48h后全铁转运蛋白组与空白对照组比较，两种细胞的增殖率分别为:胚肺成纤维细胞(117.4±1.9)%，肺腺癌细胞(185.3±5.6)%，两组比较，P<0.001。
2.3 不同干预条件下青蒿琥酯对两种细胞生长的影响
两种细胞在不用或应用全铁转运蛋白预处理后，青蒿琥酯(与顺铂比较)对其增殖的影响结果见表1。 表1 不同干预条件下48h青蒿琥酯及顺铂对 与单纯青蒿琥酯组比较，*P>0.05;**P<0.01;与任一青蒿琥酯组比较，#P<0.01
3 讨 论
目前恶性肿瘤已成为人类第一或第二位死因，其根源在于对肿瘤治疗的各种措施存在一定的局限性。对于中晚期肿瘤，化疗的地位显得尤为突出，然而化疗药的毒副作用以及肿瘤的多药耐药成为制约化疗作用发挥的瓶颈。因此人们希望找到一种对肿瘤细胞有较高毒性而对正常细胞无毒副作用的化疗药物，即具有较高选择性的药物。
青蒿素及其衍生物在世界上广泛应用于抗疟治疗，对抢救和治疗脑型和恶性疟疾具有重要作用，尤其是对多药耐药的难治性疟疾以其快速而显著的疗效和独特机制而为世界所关注。其机制 [5] 在于利用疟原虫细胞内存在的铁离子催化裂解其分子结构中的过氧桥，产生含碳自由基，该自由基烷基化细胞内蛋白，使其丧失功能，从而达到杀灭疟原虫的目的。
铁离子参与了机体遗传物质的合成、能量代谢、氧化运输等重要过程，因此它对于人的生命过程来说非常重要。细胞对于铁代谢的调节影响了细胞的增殖和分化，细胞外铁的进入是靠转铁蛋白和细胞表面表达的转铁蛋白受体的结合，由转铁蛋白受体介导实现的，因此转铁蛋白受体的表达量也与细胞对铁的需求相一致 [6] 。肿瘤细胞具有无限增殖的特点，因此其转铁蛋白受体的表达量以及对铁离子的摄取量应当比正常细胞多。
本试验结果显示，肺腺癌细胞表面转铁蛋白受体的表达量(0.54±0.06)是胚肺成纤维细胞表达量(0.11±0.04)的5倍，在增加对细胞铁离子的供应后可明显促进两种细胞的增殖，尤其是对肺腺癌细胞的促增殖作用更明显[肺腺癌细胞的增殖率(18.5±5.6)%，胚肺成纤维细胞的增殖率(117.4±1.9)%;(P<0.01)]。而青蒿琥酯对两种细胞的选择性抑制作用也与细胞表面表达的转铁蛋白受体以及细胞内铁离子含量相一致:对胚肺成纤维细胞，因转铁蛋白受体表达量低，无论有无全铁转运蛋白的预处理，200μg·ml -1 的青蒿琥酯对其抑制率仅(13.02±0.69)%;对肺腺癌细胞青蒿琥酯抑制作用随浓度的增加而增大，且在增加细胞内铁离子浓度后，其相应的抑制率增加了近20%[青蒿琥酯为200μg·ml -1 时，加转铁蛋白的抑制率为(96.12±0.43)%，单纯青蒿琥酯为(74.30± 0.32)%]，200μg·ml -1 青蒿琥酯对肺腺癌细胞的抑制 作用[(96.12±0.43)%]可与10μg·ml -1 顺铂的抑制作用[(92.65±0.56)%]相比，但10μg·ml
-1 顺铂对胚肺成纤维细胞的抑制作用却达到(36.50±0.61)%，与200μg·ml -1 青蒿琥酯抑制率[(13.02±0.69)%]相比毒副作用较大。本试验结果提示，与顺铂比较青蒿琥酯具有更好的对肿瘤细胞的选择毒性作用。需要指出的是胚肺成纤维细胞不能完全代表正常细胞特性，早在多年前人们已经注意到 [7] 在正常组织细胞中，多数细胞不表达转铁蛋白受体，即使表达其表达量也很低，如表皮角质细胞、胰腺的内分泌细胞、肝脏的实质细胞、睾丸和垂体的部分细胞等。因此对正常细胞青蒿琥酯其毒副作用应当更低，这点可从其几十年的临床应用来进一步证明 [1，5] 。
本试验结果具有一定的临床意义，中晚期肿瘤患者由于消耗增加、饮食减少等原因，常导致患者出现缺铁性贫血。若青蒿素类药物将来可以用来抗肿瘤，对于中晚期贫血的肿瘤患者可以短期内给予铁剂纠正，增强患者体质的同时给予青蒿素类药物，依其选择毒性作用杀灭肿瘤细胞，而不增加患者的痛苦。因此青蒿素类药物是值得进一步研究和开发的抗肿瘤药物。
[参考文献]
[1]BALINT G A.Artemisinin and its derivatives:an important new class of antimalarial agents[J].Pharmacol Ther，2001，90:261.265.
[2]张星，杨小平，潘启超.青蒿酯钠抗人肝癌(BEL-7402)与诱 导凋亡[J].中草药.1998，29:467.469.
[3]BEEKMAN A C，WIERENJA P K，WERDENBAG H J，et al.Ar-temisinin-derived sesquiterpene lactones as potential antitumour compounds:cytotoxic action against bone marrow and tumour cells [J].Planta Med，1998，64:615.619.
[4]周立国.药物毒理学[M].武汉:湖北科学技术出版社， 2001:33.38.
[5]DHINGRA V，VISHWESHWAR RAO K，LAKSHMI NARASUM.Current status of artemisinin and its derivatives as antimalarial drugs[J].Life Sci，2000，66:279.300.
[6]LIEU P T，HEISKALA M，PETERSON P A，et al.The roles of iron in health and disease[J].Mol Aspects Med，2001，22:1. 87.
[7]GATTER K，BROWN G，FROWBRIDGE I S，et al.Transferrin re-ceptors in human tissums:their distribution and possible clinical relevance[J].J Clin Pathol，1983，36:539.545.
(东南大学附属中大医院呼吸科，江苏南京 210009)
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(222KB，3页)。