自体移植静脉外膜涂抹雌激素防治血管再狭窄的实验研究
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[摘要]
目的 探讨局部应用雌激素防治自体移植静脉再狭窄的可行性及其机制。方法 建立家兔颈外静脉颈总动脉移植模型，分为3组。A组：单纯手术组；B组：手术+涂胶(pluronicF127 gel)组；C组：手术+17β雌二醇组。分别于术后3、7、14 d用免疫组织化学方法检测移植静脉细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、磷酸化细胞外信号调节激酶(pERK1/2)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况；HE、Masson染色后应用计算机图像分析系统检测术后14 d移植静脉内膜、中膜增生情况及内膜厚度/中膜厚度(I/M)比值。结果 术后14 d，C组移植静脉内膜厚度、中膜厚度、I/M比值明显低于A组(P<0.05或P<0.01)；术后3、7、14 d，在同一时间点，C组的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖率、ERK阳性细胞率、pERK阳性细胞率均低于A组，差异有显著性。结论 用携带17β雌二醇的pluronicF127 gel涂抹自体移植静脉外膜能抑制VSMC增殖，减轻移植静脉内膜、中膜增生，具有防治移植静脉再狭窄的作用，其机制可能是抑制移植静脉壁ERK的磷酸化。
[关键词] 17β雌二醇;静脉;移植;再狭窄;细胞外信号调节激酶
[中图分类号] R33；R541.4
Prevention of autologous vein graft restenosis by smearing estrogen on the testing vessel adventitia
LI Haiqing，LIU Zhiyong
(Department of Cardiothoracic Surgery,Zhongda Hospital，Southeast University,Nanjing 210009,China)
Abstract：Objective To evaluate the possibility of smearing 17βestradiol on the testing vessel and investigate it′s mechanism for preventing vein graft failure.Methods Rabbits model of jugular veins grafted into the common carotid arteries were established. Animals were randomly divided into group A(operation group)，group B(operation+smearing pluronicF127 gel group),and group C(operation+17βestradiol group). Immunohistochemical procedure was used to localize extracellular signal regulated kinase1/2(ERK1/2)，phosphorylated extracellular signal regulated kinase1/2(pERK1/2) and proliferating cell nuclear antigen(PCNA) three days,seven days and fourteen days after the operation. Fourteen days after the operation,the thickness of neointima and media and neointima/media ratios(I/M) were calculated from the sections stained with HE and Masson by computer image analysis.Results Fourteen days after the operation，the thickness of neointima,media and I/M ratios in group C were significantly less than those of group A respectively. At the same time point,the proliferating rate of VSMC,the ERK positive cell rate and the pERK positive cell rate in group C decreased significantly than those of group A.Conclusions Smearing 17βestradiol mixed with the pluronicF127 gel on the autologous vein grafts can inhibit the proliferation of VSMC and alleviated the hyperplasia of both neointima and media.The mechanism is probably to inhibit ERK phosphorylation.These results highlight the potential therapeutic benefit in treating vein graft failure.
Key words：17βestradiol；vein;graft;restenosis;extracellular signal regulated kinase
自体移植静脉再狭窄是影响冠状动脉旁路移植术(CABG)疗效的主要因素。雌激素对血管系统具有保护作用，较多实验表明雌激素可干预血管再狭窄。本实验模仿人大隐静脉冠状动脉旁路移植术，建立家兔自体静脉移植模型，在移植静脉外膜涂抹由pluronicF127gel携带的雌激素，观察其对血管再狭窄的影响及可能机制，为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
普通级雄性家兔54只(东南大学医学院动物实验中心提供)，体重2.4~2.7kg。随机分为3大组，A组：单纯手术组；B组：手术+涂胶(pluronicF127gel)组；C组：手术+17β雌二醇(E2)组，17β雌二醇由pluronicF127 gel携带局部涂抹。各组均随机分为3d组、7d组、14d组，每个小组6只家兔。
1.2 试剂配制
17β雌二醇和pluronicF127gel均购自Sigma公司，增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞外信号调节激酶(ERK)、磷酸化细胞外信号调节激酶(pERK)等一抗、二抗以及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，Masson染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。称取pluronicF127gel粉末 02g加入灭菌的 PBS1ml(001mol·L-1，pH7.6)中，充分搅拌，即制成pluronicF127gel；如需加入E2，则称取17β雌二醇30mg加入1mlPBS(001mol·L-1)中,再加入 pluronicF127gel粉末 02g，充分搅拌，即制成17β雌二醇和pluronicF127gel混合物[12]。
1.3 建立自体静脉移植模型
家兔以3%戊巴比妥钠30mg·kg-1腹腔麻醉，固定、消毒，颈部正中切口，游离并剪取左颈外静脉20~30cm,用含030g·L-1罂粟碱、015g·L-1肝素钠生理盐水灌注；无创血管夹夹闭游离的左颈总动脉两端，剪除中段1.0~1.5cm，80无损伤线缝合倒置静脉段，行动静脉端端间断吻合，吻合口无渗血后，A组家兔不做处理，B组家兔移植静脉外膜单纯涂抹配制好的pluronicF127gel，C组家兔涂抹配制好的17β雌二醇和pluronicF127gel混合物，然后逐层缝合切口。
1.4 标本分析
术后3、7、14d取材，获取移植静脉段，4%中性甲醛固定，每段血管分3等份横断，石蜡包埋，连续切片，免疫组织化学检测PCNA、ERK1/2、pERK1/2，每个标本取6个视野，400倍光镜下分别记数每个视野中的阳性细胞数和总细胞数的比值，计算其平均值。HE、Masson染色后测量移植静脉内膜厚度(I)、中膜厚度(M)以及内膜厚度/中膜厚度(I/M)值，每个标本取6个视野，400倍光镜观察，计算其平均值。
1.5 统计学分析
所有数据以x-±s表示，采用SPSS 11.5软件进行方差分析，组间比较应用q检验，P<005为差异有显著性，P<001为差异有极显著性。
2 结果
2.1 各组移植物静脉内膜、中膜厚度及I/M值
实验中家兔因大量失血致死1例，2例血管桥堵塞，但损失样本均补足。经HE和Masson染色可见，术后14d各组移植静脉内膜、中膜均不同程度地增厚。C组内膜、中膜厚度及I/M值均低于A组(P<005或P<001)，见表1。
表1 术后14d各组移植静脉内膜、中膜厚度及I/M值结果(略)
2.2 各组移植静脉VSMC增殖率、ERK及pERK阳性率
术后3、7、14d，移植静脉内膜、中膜均出现数量不等的PCNA阳性、ERK阳性、pERK阳性的血管平滑肌细胞(VSMC)。根据公式：VSMC增殖率=PCNA阳性着色细胞数/总细胞数，ERK阳性细胞率=ERK阳性着色细胞数/总细胞数，pERK阳性率=pERK阳性着色细胞数/总细胞数。各组移植静脉VSMC增殖率、ERK阳性率、pERK阳性率分别见表2、3、4。
表2 术后各组移植静脉VSMC增殖率(略)
表3 术后各组移植静脉VSMC ERK阳性率(略)
表4 术后各组移植静脉VSMC pERK阳性率(略)
3 讨论
大隐静脉因具有取材方便、量多、长度可以抵达乳内动脉无法到达的远端分支等优点，成为冠状动脉旁路移植术中使用最多的移植血管，但术后10年静脉旁路的通畅率约为50%，5年内需再次手术者为3%~5%[3]。血管再狭窄的主要病理特征为内膜显著增厚[4]。大量实验研究表明，中膜血管平滑肌细胞在血管再狭窄发生过程中起着重要作用[5]。目前对防治血管再狭窄的研究主要着眼于抑制血管壁的不同成分参与血管再狭窄的形成。
我们的实验模仿大隐静脉冠状动脉旁路移植术，术中在家兔的移植静脉外膜涂抹由pluronic F127 gel所携带的17β雌二醇混合物，术后14d，C组与A组相比，移植静脉内膜、中膜厚度分别减少约77.05%、2693%，I/M减少约73.08%。I/M的比值减少得越多，说明抑制血管内膜增生越明显。而术后3、7、14d，在同一时间点，C组与A组相比，移植静脉壁中VSMC增殖率分别降低4030%、41.85%、4058%。可以看出，雌激素在第7天时抑制内膜增生作用最强。
雌激素作用于血管壁的不同成分及血管活性肽均可产生血管系统的保护作用。Simoncini等[6]分离培养人脐静脉内皮细胞，即刻浸泡于7nmol·L-1的17β雌二醇1h或持续浸泡于029nmol·L-1的17β雌二醇24h，两者都能触发基因组途径，引起内皮细胞一氧化氮合酶(NOS)表达增高。DaiDo[7]用绝经后女性及年龄相当的男性的大隐静脉进行VSMC培养，发现E2可以抑制PDGF诱导的DNA合成及VSMC的增殖、迁移，且与性别无关。Hwang等[1]研究表明，17β雌二醇呈浓度依赖性地抑制体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞的增殖及ERK1/2的活性，在雌激素浓度为100nmol·L-1时，抑制强度最大。提示雌激素抗大鼠主动脉血管平滑肌细胞增殖作用可能与抑制ERK1/2促有丝分裂途径有关，但没有影响其他丝裂原活化蛋白激酶(JNK,P38)的活性。Oparil等[8]用去势的雌鼠建立右颈总动脉再狭窄模型，实验结果表明，全身应用雌激素干预可以减少血管损伤后3d血管外膜BrDU阳性细胞数，并且28d后新生血管内膜面积明显减少，说明雌激素抑制新生内膜面积可能与抑制外膜成纤维细胞的活化或转型有关，同时，也间接说明了血管外膜成纤维细胞参与血管再狭窄的形成。
然而，雌激素对心血管系统保护作用的具体机制还不十分清楚。本实验重点检测了自体移植静脉壁中VSMC的ERK及pERK的表达情况。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族是一组具有丝氨酸和苏氨酸双磷酸能力的蛋白激酶，广泛存在于各种细胞中。现已证实，MAPK家族中至少包括3个成员：ERK1/2、cJun氨基末端激酶(JNK)和p38MAPK。ERK1/2通路是MAPK信号转导通路的枢纽，也是介导细胞增殖的重要途径。所以，ERK1/2通路在移植静脉再狭窄、闭塞中的作用日益受到关注。从本实验结果可以看出，静脉移植后ERK1/2表达的变化与移植静脉内膜增生的规律基本一致，与VSMC的PCNA表达也呈正相关，据此，可以推测ERK1/2与移植静脉再狭窄关系密切。机械损伤、动脉血流高压冲击及其剪切力、缺血再灌注、细胞因子、炎性介质等引起移植静脉壁中ERK1/2磷酸化，随后，活化的ERK1/2引起一系列调节生长的分子发生磷酸化，使细胞外生长调节信号传入细胞核，触发细胞核内增殖程序，引起细胞增殖。在这一过程中，ERK1/2发生磷酸化可能是该机制之一。本实验结果显示，术后3、7、14d，C组移植静脉壁细胞ERK阳性率比A组分别减少2001%、54.28%、38.54%，而pERK阳性率则分别减少1742%、6305%、6923%。说明了(1)雌激素对自体移植静脉壁中的ERK及pERK的表达具有抑制作用；(2)雌激素抑制自体移植静脉再狭窄可能的机制是抑制了ERK发生磷酸化；(3)ERK1/2的磷酸化在移植静脉发生再狭窄中起着重要作用。
雌激素的长期应用或大剂量应用可增加子宫内膜癌、乳腺癌、胆囊炎、血栓形成等风险。本实验在移植静脉外膜涂抹雌激素不仅保证了有效的作用部位、作用时间、作用浓度，还避免了全身应用雌激素的副作用。虽然近年有学者采用经导管局部给药、经球囊涂抹血管腔面、支架携带等方法抑制血管再狭窄，但由于受到血流冲刷影响，经导管局部灌注和球囊涂抹使得药物难以在血管腔面长期停留；涂层支架成本高，用于实验研究尚不实际。本实验采用在血管外膜涂抹药，具有方便、经济，安全等优点，但目前需要寻找、研究开发一种携带药物更持久、对人体无害的载体。
总之，用携带17β雌二醇的pluronicF127gel涂抹自体移植静脉外膜能抑制VSMC增殖，减轻移植静脉内膜、中膜增生，机制可能是抑制移植静脉壁ERK的磷酸化，从而产生防治移植静脉再狭窄的作用。
[参考文献]
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(东南大学附属中大医院 心胸外科，江苏 南京 210009)
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