脉络膜微血管内皮细胞的体外培养
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[关键词]脉络膜;血管内皮细胞;细胞培养
脉络膜微血管内皮细胞不仅在维持眼睛局部的内环境稳定、局部散热以及营养视网膜色素上皮细胞(RPE)和外层视网膜等方面发挥重要作用，更是许多视网膜、脉络膜病变的解剖基础，包括脉络膜渗漏、炎症以及新生血管的发生等等[1]。脉络膜新生血管的发生是一系列引起视功能障碍的脉络膜、视网膜疾病的重要病理生理学机制，尤其在渗出性老年黄斑变性、中心性渗出性视网膜炎、高度近视眼底改变等方面，脉络膜新生血管是致盲的根本原因。脉络膜新生血管是脉络膜的异常血管发生与血管生成，在此过程中，脉络膜微血管内皮细胞起重要作用[2]。虽然目前有不少学者应用一些较易培养的血管内皮细胞(譬如人脐静脉血管内皮细胞)在体外研究血管障碍，但不同部位的血管内皮细胞不论是在表型抑或是抗原性上皆表现出较明显的异质性[3]。因此，体外成功分离、培养脉络膜微血管内皮细胞对于研究脉络膜新生血管具有十分重要的意义。现就近年来国内外有关脉络膜微血管内皮细胞体外培养的研究情况综述如下。
1 脉络膜的取材
脉络膜微血管内皮细胞体外培养的取材目前主要源于牛眼[45]及人眼[67]，迄今国内外尚无其他来源的相关报道。牛眼球一般要求在牛屠宰后1~2h内剜取[45，812]，而人眼球时间限制则可以略微放宽，人死亡后30h内尽快剜取即可[67]。取出眼球后立即去除外围肌肉、结膜以及结缔组织等，用70%酒精或无离子水清洗，再用含1%青(链)霉素的HBSS或含400mg·L-1庆大霉素的PBS浸泡，然后沿赤道部剪除眼前节，而后去除晶状体、玻璃体以及视网膜制成眼杯，再用橡皮刷机械刮除RPE或配合使用中性蛋白酶机械刮除，并将脉络膜从巩膜上分离出[412]。在此过程中，应严格无菌操作。
2 脉络膜微血管内皮细胞的分离
组织块分离方法主要有机械分散法、剪切分离法以及消化分离法。目前从脉络膜上分离微血管内皮细胞主要采用剪切联合消化分离法，具体可分为一步法和两步法。
2.1 一步法——用酶消化法直接从脉络膜组织中分离出内皮细胞
剪碎脉络膜经含有10mmol·L-1羟乙基哌嗪乙磺酸、100U·ml-1青霉素、100mg·L-1链霉素以及1%牛血清白蛋白的HBSS冲洗后，加入0.5%胰蛋白酶和0.02%EDTA在4℃下孵育3h，再用含有0.1%胶原酶、0.15mg·L-1甲苯磺酰基赖氨酸氯氨基甲酮以及20 U·ml-1Ⅱ型DNA酶1的HBSS在37℃下孵育30min，经清洗后用Percoll密度梯度离心(1000r·min-1)20min,从上往下收集第2层细胞[57，911]。
2.2 两步法——首先从脉络膜上分离出脉络膜微血管，然后分离出内皮细胞
剪碎脉络膜后要分离出微血管目前有两种方法：可采用直接在倒置相差显微镜下机械挑取微血管的方法；亦可加入用2mmol·L-1 EDTA·4Na配制的0.25%胰蛋白酶在4℃消化18~20h，再在37℃搅拌消化12~15min，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，然后用单层纱布多次过滤冲洗，最后的滤液用孔径为30~50μm的尼龙膜过滤，保留滤渣至PBS中，在体视显微镜下用玻璃丝挑取呈半透明的脉络膜微血管片[4，8，12]。
分离出脉络膜微血管后，一般采用胶原酶消化法分离内皮细胞。在微血管片中加入用TrisHCl(pH7.5)配制的0.2%胶原酶消化液在37℃消化30min，然后加入含20%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，1000r·min-1离心10min,收集细胞[412]。
3 脉络膜微血管内皮细胞的纯化
不论是一步或两步法所收集到的微血管内皮细胞，皆存在混杂细胞(如微血管周细胞、成纤维细胞、RPE、平滑肌细胞等)污染的问题。如今纯化脉络膜微血管内皮细胞主要采用以下3种方法：(1)机械刮除法——将所收集的细胞接种于培养板，原代培养2d左右可在倒置相差显微镜下，通过辨认细胞形态机械刮除首先贴壁的混杂细胞[4]； (2)克隆法——将所收集的细胞接种于培养板，原代培养3~5d可见原代内皮细胞克隆，在倒置相差显微镜下直接挑取纯内皮细胞集落[56]；(3)磁珠法——在所收集的细胞悬液中加入包被的磁珠共孵育，然后运用磁性离心器分离收集结合有磁珠的细胞，从而达到纯化细胞的目的。纵观国内外文献迄今主要有3种磁珠包被物：鼠抗人CD31单抗IgG1、LEA(lycopersicon esculentum)以及UEAⅠlectin(ulex europaeus Ⅰlectin) 。这3种包被物皆对内皮细胞具有一定的选择性与特异性，能够选择性地结合于内皮细胞表面的CD31抗原或糖位点[710，12]。
前两种方法简单易行，但容易污染，纯化率不高且耗时长，内皮细胞表面受体丢失的可能性大，如M受体；第三种方法中包被磁珠对于内皮细胞的特异性高、内皮细胞纯化率高且耗时短，但是所用磁珠包被技术要求高，磁性离心器亦价格昂贵，不易普及。
4 脉络膜微血管内皮细胞的培养
4.1 原代培养
将收集到的细胞制成细胞悬液后，即可接种于培养器皿中进行原代培养。鉴于脉络膜微血管内皮细胞较难分离及纯化，易混杂有其他细胞如微血管周细胞、平滑肌细胞以及RPE等，故常需在原代培养中去除混杂细胞以得到纯化内皮细胞。若采用机械刮除或克隆法则常选用培养板以便于操作，而若采用磁珠法则一般选用培养瓶。不同的培养基对内皮细胞的生长也有影响，而纤维连接蛋白(FN)或透明质酸包埋的培养器皿是内皮细胞最合适的营养基，可促进内皮细胞的贴壁、生长，又可一定程度地限制微血管周细胞的生长[13]。
目前常采用的培养液主要有M199、HAMF10以及 IMDM 等，不论应用何种基础培养液，一般都需要加入一些辅助因子。目前主要有以下几种配方：(1)内皮细胞生长添加剂(75μg·ml-1)、硫酸肝素(100μg·ml-1)、抗坏血酸(25μg·ml-1)、青霉素(100U·ml-1)、链霉素(100μg·ml-1)以及胎牛血清(10%)[5]；(2)内皮细胞生长添加剂(100μg·ml-1)、胰岛素(20μl·ml-1)、青链霉素(0.5mg·ml-1)以及人灭活血清(20%)[7];(3)牛脑提取液(12μg·ml-1)、氢化可的松(1μg·ml-1)、庆大霉素(100μg·ml-1)以及胎牛血清(30%)[9]。加入内皮细胞生长添加剂及肝素可促进内皮细胞生长及纯化[14]；加入抗生素能预防污染；而之所以加入一定浓度的血清，是因为在血液凝固过程中，血小板聚集时所释放的各种生长因子有刺激内皮细胞生长的作用，尤其是血小板能够释放一种血小板衍生的生长因子(PDGF)[15]。原代培养中，一般要求每2天换液1次，每次换液前均需在倒置相差显微镜下刮去已贴壁的混杂细胞[412]。
4.2 传代培养
原代培养7~10d，当培养的内皮细胞汇合成单细胞层后进行传代培养。而如果细胞尚没有生长到足以覆盖培养器皿的大部分表面(80%)以前，不要急于传代。
多采用胰蛋白酶联合EDTA消化法进行传代，但不同的实验室不同的条件下所采用的胰蛋白酶浓度、消化时间及温度又有所不同。詹永乐等[4]报道,应用0.53mmol·L-1 EDTA·4Na(HBSS配制)配制的0.05%胰蛋白酶消化液，在37℃消化2~4min,消化的同时在倒置相差显微镜下观察，当大多数细胞呈球形悬浮于消化液中时，立即加入含20%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，1000r·min-1离心3~5min,收集细胞后加入内皮细胞生长培养液成细胞悬液，然后按1∶25扩增比例接种于包埋有FN的培养板继续培养。
传代培养时所用的培养液可有别于原代培养，即少加入内皮细胞生长添加剂、硫酸肝素及抗坏血酸等，如可用含有谷氨酸(100μg·ml-1)、胎牛血清(10%)、青霉素(100U·ml-1)以及链霉素(100μg·ml-1)的HAMF10 培养液[5]或加有青霉素(100U·ml-1)、链霉素(100μg·ml-1)以及胎牛血清(10%)的M199培养液[6]。内皮细胞的培养环境一般为具有一定湿度的CO2体积分数为5%的37℃恒温培养箱。
5 脉络膜微血管内皮细胞的鉴定
5.1 细胞生长与形态观察
5.1.1 倒置相差显微镜观察 内皮细胞原代及传代培养过程中所特有的生长特征及其内皮细胞散在与汇合时的特殊形态，尤其是当脉络膜微血管内皮细胞生长汇合成单细胞层时，呈现典型的鹅卵石样外观或极少呈梭形[4，6,9]。
5.1.2 透射电子显微镜超微结构观察 此种方法由Gimbrone等[16]首先提出。他们发现内皮细胞有如下两个特点：有WP小体及FⅧRAg。WP小体仅见于内皮细胞，被认为是内皮细胞鉴定最好的形态学指标。脉络膜微血管内皮细胞超微结构观察可见WP小体[6，16]。
5.2 血管样管状结构形成
目前有不少实验室发现，把培养的脉络膜微血管内皮细胞接种至胶原凝胶培养基(Ⅰ型)，在一定的培养液及一定的条件下孵育，倒置相差显微镜下观察可以发现内皮细胞形成血管样管状结构，透射电镜观察尚可以发现此类细胞具有丰富的细胞器、细胞间具有连接结构、管状结构外侧具有基底膜样结构以及脉络膜血管内皮细胞所特有的窗孔样结构[1，5，6，9]。
5.3 FⅧRAg 的检测
FⅧRAg除见于内皮细胞外，还见于巨核细胞和血小板内，也被认为是鉴定内皮细胞的可靠指标[16]。Vagner等[17]还发现FⅧRAg是由内皮细胞合成并存储在胞质内的WP小体中。FⅧRAg的鉴定方法多采用间接免疫荧光法，一般用兔抗人一抗以及异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔二抗。
5.4 乙酰化LDL受体的检测
内皮细胞表面存在LDL受体，是一种酸性糖蛋白。LDL受体鉴定多采用直接掺入法，即在内皮细胞培养液中加入1二甲基氨基5磺酰氯荧光素标记的LDL孵育一定时间，若细胞的胞核周围胞质呈强黄色荧光，则表明存在LDL受体[18]。
5.5 CD31、CD34的检测
Penfold等[7]发现CD31、CD34亦是脉络膜内皮细胞组成型表达的抗原，培养的脉络膜内皮细胞约有95%显示阳性，可以作为鉴定内皮细胞的一个辅助性指标，多采用间接免疫荧光法来鉴定。
[参考文献]
[1]GUYER D R, SCHACHAT A D, GREEN W R. The choroids: structural considerations [J].Retina,1994,1:1831.
[2]GROSSNIKLAUS H E, GREEN W R. Choroidal neovascularization[J]. Am J Ophthalmol, 2004, 137(3):496503.
[3]ARID W C. Endothelial cell heterogeneity: a case for nature and nurture [J]. Blood,2004,103:39943995.
[4]詹永乐,李维业,MYRON Y. 牛脉络膜微血管内皮细胞的分离培养和鉴定[J]. 解剖学报,1997,28(3):297301.
[5]SAKAMNOTO T, SAKAMOTO H, MURPHY T L, et al. Vessel formation by choroidal endothelial cells in vitro is modulated by retinal pigment epithelial cells [J].Arch Ophthalmol,1995,113(4):512520.
[6]SAKAMOTO T, SAKAMOTO H, HINTON D R, et al. In vitro studies of human choroidal endothelial cells [J]. Curr Eye Res,1995, 14(8):621627.
[7]PENFOLD P L, LI W, MADIGAN M C, et al. Modulation of permeability and adhesion molecule expression by human choroidal endothelial cells [J].Invest Ophthalmol Vis Sic,2002,143(9):31253130.
[8]SPRAUL C W, BALDYSIAKFIGIEL A, LANG G K, et al. Octreotide inhibits growth factorinduced bovine choriocapillary endothelial cells in vitro [J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2002,240:227231.
[9]HOFFMANN S, SPEE C, MURATA T, et al. Rapid isolation of choriocapillary endothelial cells by lycopersicon esculentUmcoated dynabeads[J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,1998,236:779784.
[10]WANG Y S, FRIEDRICHS U, EICHLER W, et al. Inhibitory effects of triamcinolone acetonide on b FGFinduced migration and tube formation in choroidal microvascular endothelial cells [J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2002,240:4248.
[11]STEINLE J J, GRANGER H J. Nerve growth factor regulates human choroidal, but not retinal endothelial cell migration and proliferation [J]. Auton Neurosci,2003,108:5762.
[12]HOFFMANN S, FRIEDRICHS U, EICHLER W, et al. Advanced glycation end products induce choroidal endothelial cell proliferation, matrix metalloproteinase2 and VEGF upregulation in vitro [J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2002,240:9961002.
[13]BOWERSOX J C, SORGEN TE N. Differential effects of soluble and immobilized fibronectin on aontic endothelial cell proliferation and attachment in vitro [J]. In vitro Cell Dev Biol,1987,23(11):759764.
[14]THRONTOR S C. Using of heparin in cloning and longterm serried cultivation [J]. Science,1983,222(7):623630.
[15]GAJDUSCK C. An endothelial cellderived growth factor [J]. J Cell Biol,1980,85(5):467470.
[16]GIMBRONE M A, COTRAN R S, FOLKMAN J, et al. Human vascular endothelial cell in culture growth and DNA sythesis [J]. J Cell Biol,1974,60(3):673684.
[17]VAGNER D D, MARDER V J. Biosynthesis of von willebranb protein by human endothelial cell: processing steps and their intracell localization [J]. J Cell Biol,1984,99(6):21232130.
[18]JAFFE E A, HOYER L W, NACHMAN R L. Synthesis of antiemophillic factor antigen by cultural human endothelial cells [J]. J Clin Invest,1973,52(11):27572764.
(东南大学附属中大医院 眼科，江苏 南京 210009)
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