乳腺癌中NDRG-1基因甲基化状态研究(2)
参见附件(441kb)。
1.4PCR扩增
为了能同时扩增甲基化和非甲基化DNA，设计的引物中不含有CpG位点。前引物PF-5′-GGTTTA GGGTGTGTTATAGTGTAATA-3′,后引物PR-5′-CCTA ACTCCAACCAACTCAAAAA-3′(扩增基因序列Genebank no：NC_000008.9，前引物位置为781-806，后引物位置为933-957)。PCR反应体系50μl，其中含10×buffer3μl，Mg2+1.8mmol•L-1，dNTPs200μmol•L-1，每条引物各1μl，模板DNA2μl，Taq DNA聚合酶2U。PTC-225 热循环仪(MJ Research)上进行PCR扩增：95℃预变性5min，然后95℃变性50s，59℃复性45s，72℃延伸45s，共35个循环，最后72℃再延伸5min。取 5μlPCR反应产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，Syngene公司凝胶成像系统下观察并记录图像。采用DNA纯化试剂盒(TAKARA)对PCR产物进行纯化，纯化后的DNA进行芯片点样。
1.5阴性阳性样本克隆与测序
正常人血液DNA扩增的阴性PCR产物和经过M.SssI处理DNA扩增阳性PCR产物割胶纯化(TAKARA)，克隆到pMD18-T载体(TAKARA)中(根据pMD18-T载体说明书操作)，分别挑取2个阴性和阳性克隆并测序(由上海英骏生物技术有限公司完成)，测序正确的克隆提取质粒并保存于-20℃待用。
1.6 探针及丙烯酰胺标记引物合成
寡核苷酸探针由上海英骏生物技术有限公司合成并标记，PM1-3#是与甲基化的位点完全匹配的探针，标记为cy5；PU1-3#是与未甲基化的位点完全匹配的探针，标记为cy3。NDRG-1-P-L#是丙烯酰胺标记引物，由上海超世生物公司合成并标记，标记为Acrydite。见表1。
表1 探针与PCR扩增未经亚硫酸氢钠处理的原序列
1.7 芯片制备
将纯化后的PCR产物与丙烯酰胺、10%过硫酸胺和甘油等按照比例混合后，吸取20μl样本点至一块384孔板(AxyGen)，准备机点或者手点。机点采用点样仪(CapitalBio SmartArrayerTM-48)将准备好的PCR产物点于处理好的玻片上，两个点圆心之间的距离为300~500μm。
1.8 杂交
取等量PM1-3#和PU1-3#混合，使得每种探针浓度为1pmol•L-1，再与杂交液(Telechem)1∶3混合。取25μl探针溶液均匀覆盖于玻片上面，加盖经离水处理的盖玻片，放入湿润密闭的杂交盒中，45℃、37℃各杂交1h。取出玻片，用70%甲酰胺70℃变性15min，变性电泳1h，在室温下用灭菌双蒸水反复清洗后氮气吹干玻片。
1.9 图像扫描与数据处理
杂交清洗后的玻片采用双色共聚焦扫描仪[CapitalBio LuxScanTM-10K(A)，中国博奥]扫描，分别记录cy3和cy5滤片扫描的图像，采用Genepix Pro 3.0分析结果，记录每个点的荧光强度，最后将记录下来的数据用Microsoft Office Excel 2003统计并制表。统计分析用SPSS13.0软件，采用t检验，P0.05)。
图6 乳腺癌标本和癌旁组织标本PCR产物微阵列芯片荧光结果图
3 讨 论
DNA甲基化与肿瘤的发生有着密切关系，它作为表观遗传学的一种调控机制是最早被人们发现的。肿瘤可发生许多种基因的异常甲基化，包括抑癌基因、DNA损伤修复基因及与肿瘤代谢和浸润相关的基因。DNA高甲基化，不仅可以直接或间接影响基因转录，也可导致C→T突变；引起基因表达异常，导致细胞恶变，最终形成肿瘤[10-12]。
甲基化状态的改变可以导致基因结构和功能的异常，进而导致细胞发生癌变，最重要的甲基化碱基是胞嘧啶，通常发生在启动子区CpG岛区域。CpG岛甲基化可以抑制启动子序列的基因表达 ......
1.4PCR扩增
为了能同时扩增甲基化和非甲基化DNA，设计的引物中不含有CpG位点。前引物PF-5′-GGTTTA GGGTGTGTTATAGTGTAATA-3′,后引物PR-5′-CCTA ACTCCAACCAACTCAAAAA-3′(扩增基因序列Genebank no：NC_000008.9，前引物位置为781-806，后引物位置为933-957)。PCR反应体系50μl，其中含10×buffer3μl，Mg2+1.8mmol•L-1，dNTPs200μmol•L-1，每条引物各1μl，模板DNA2μl，Taq DNA聚合酶2U。PTC-225 热循环仪(MJ Research)上进行PCR扩增：95℃预变性5min，然后95℃变性50s，59℃复性45s，72℃延伸45s，共35个循环，最后72℃再延伸5min。取 5μlPCR反应产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，Syngene公司凝胶成像系统下观察并记录图像。采用DNA纯化试剂盒(TAKARA)对PCR产物进行纯化，纯化后的DNA进行芯片点样。
1.5阴性阳性样本克隆与测序
正常人血液DNA扩增的阴性PCR产物和经过M.SssI处理DNA扩增阳性PCR产物割胶纯化(TAKARA)，克隆到pMD18-T载体(TAKARA)中(根据pMD18-T载体说明书操作)，分别挑取2个阴性和阳性克隆并测序(由上海英骏生物技术有限公司完成)，测序正确的克隆提取质粒并保存于-20℃待用。
1.6 探针及丙烯酰胺标记引物合成
寡核苷酸探针由上海英骏生物技术有限公司合成并标记，PM1-3#是与甲基化的位点完全匹配的探针，标记为cy5；PU1-3#是与未甲基化的位点完全匹配的探针，标记为cy3。NDRG-1-P-L#是丙烯酰胺标记引物，由上海超世生物公司合成并标记，标记为Acrydite。见表1。
表1 探针与PCR扩增未经亚硫酸氢钠处理的原序列
1.7 芯片制备
将纯化后的PCR产物与丙烯酰胺、10%过硫酸胺和甘油等按照比例混合后，吸取20μl样本点至一块384孔板(AxyGen)，准备机点或者手点。机点采用点样仪(CapitalBio SmartArrayerTM-48)将准备好的PCR产物点于处理好的玻片上，两个点圆心之间的距离为300~500μm。
1.8 杂交
取等量PM1-3#和PU1-3#混合，使得每种探针浓度为1pmol•L-1，再与杂交液(Telechem)1∶3混合。取25μl探针溶液均匀覆盖于玻片上面，加盖经离水处理的盖玻片，放入湿润密闭的杂交盒中，45℃、37℃各杂交1h。取出玻片，用70%甲酰胺70℃变性15min，变性电泳1h，在室温下用灭菌双蒸水反复清洗后氮气吹干玻片。
1.9 图像扫描与数据处理
杂交清洗后的玻片采用双色共聚焦扫描仪[CapitalBio LuxScanTM-10K(A)，中国博奥]扫描，分别记录cy3和cy5滤片扫描的图像，采用Genepix Pro 3.0分析结果，记录每个点的荧光强度，最后将记录下来的数据用Microsoft Office Excel 2003统计并制表。统计分析用SPSS13.0软件，采用t检验，P0.05)。
图6 乳腺癌标本和癌旁组织标本PCR产物微阵列芯片荧光结果图
3 讨 论
DNA甲基化与肿瘤的发生有着密切关系，它作为表观遗传学的一种调控机制是最早被人们发现的。肿瘤可发生许多种基因的异常甲基化，包括抑癌基因、DNA损伤修复基因及与肿瘤代谢和浸润相关的基因。DNA高甲基化，不仅可以直接或间接影响基因转录，也可导致C→T突变；引起基因表达异常，导致细胞恶变，最终形成肿瘤[10-12]。
甲基化状态的改变可以导致基因结构和功能的异常，进而导致细胞发生癌变，最重要的甲基化碱基是胞嘧啶，通常发生在启动子区CpG岛区域。CpG岛甲基化可以抑制启动子序列的基因表达 ......
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