Ang-2、VEGF及MVD在胃癌中的表达及其临床意义(2)
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1 资料与方法
1.1 一般资料
51例胃癌标本，其中男28例，女23例，年龄35~76岁，平均62.4岁。高、中分化胃癌29例，低分化胃癌22 例。TNM 分期Ⅰ-Ⅱ期20例，Ⅲ-Ⅳ期31例。均为2005年1月至2006年6月徐州市中心医院临床和病理资料完整的手术切除原发胃癌标本。24例正常胃黏膜标本作为对照。
1.2 试剂
兔抗人Ang-2及VEGF多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，鼠抗人CD34单克隆抗体、Supervision试剂购自上海长岛生物技术有限公司。
1.3 方法
采用免疫组化两步法进行。手术标本经4%甲醛固定，石蜡包埋切片，石蜡切片4μm贴在涂有切片黏合剂的载玻片上，58℃烤4h，切片用二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。浸入3%的双氧水中30min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。 然后将玻片置入0.01mol•L-1、pH6.0的柠檬酸缓冲液中微波抗原热修复(95℃10min)。自然冷却至室温。山羊血清培育30min以封闭非特异性抗原，分别滴加兔抗人Ang-2及VEGF多克隆抗体(工作浓度1∶50)，鼠抗人CD34单克隆抗体(工作浓度1∶100)，置4℃冰箱过夜，37℃复温30min。加入Supervision试剂，37℃10~15min。用DAB显色，自来水洗涤，复染(苏木素衬染30s，水洗，盐酸乙醇蓝化2s，水洗，微波蓝化)。以上每步均用PBS浸洗3次，每次5min。中性树胶封固，光镜下观察。
1.4 阳性结果判断
以PBS替代第一抗体作阴性对照，已知阳性片作阳性对照。免疫组化染色显示细胞膜或细胞浆染成棕褐色或棕黄色为Ang-2和VEGF阳性表达，随机选择5个高倍视野(×400)，连续记数500个肿瘤细胞中阳性细胞数。①以着色细胞占视野细胞总数的多少分0～3级。0级:0;1级:50%。②按着色细胞染色强弱分0~3级。0级:阴性;1级:弱,淡黄色;2级:中等,棕黄色;3级:强,棕褐色。按①②值相加判断结果,以0～2为阴性“-”;3～4为弱阳性“+”；5～6为强阳性“++”。将“+”和“++”都计为阳性，以简化数据处理。
1.5 MVD计数
在肿瘤区凡是染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为一个血管计数，每例首先在低倍镜下(×100)选择微血管密度最高的肿瘤区域，然后在高倍光镜下(×400)，随机计数5个视野内微血管数，再求其平均值为微血管密度。计数时管腔直径≤50μm者判为微血管，直径>50μm或管壁含有肌层者不作为微血管计数，另外单个染色细胞或成群无管腔的染色细胞也作为独立微血管计数。
1.6 统计学处理
MVD以x-±s表示。计数资料的比较采用χ2检验，计量资料的比较采用t检验；等级相关采用Spearman等级相关分析。P
2.2Ang-2、VEGF表达与胃癌临床病理特征的关系
Ang-2表达与胃癌患者的年龄、性别、分化程度无关(P>0.05)，而与肿瘤大小、有无淋巴结转移、浸润深度、TNM分期有关(均P9.17，P<0.01)。VEGF与胃癌的大小(χ2=10.54，P11.2,明显高于Ⅰ-Ⅱ期的MVD(27.2±8.5)(t=3.07,P<0.01)。
2.3 Ang-2表达与MVD在胃癌中的相关性
在20例Ang-2阴性表达者中MVD为25.1±10.3，而在31例Ang-2阳性表达者中MVD为36.7±11.4，Ang-2表达阳性与阴性者MVD差异有统计学意义(t=3.68,P<0.01)。经相关分析显示，在胃癌组织中Ang-2表达与MVD呈正相关(r=0.71，P<0.01)
2.4 胃癌组织中VEGF表达与MVD的相关性
胃癌组织中VEGF阳性表达者的MVD为35.7±10.3，VEGF阴性表达者的MVD为24.6±11.7，VEGF表达阳性与阴性者MVD差异有统计学意义(t=3.6,P<0.01)。经相关分析显示，胃癌组织中VEGF与MVD呈正相关(r=0.858，P<0.01)。
2.5 胃癌组织中Ang-2表达与VEGF的相关性
51例胃癌组织有20例Ang-2表达阴性，24例VEGF表达阴性。在20例Ang-2阴性表达者中VEGF同时为阴性的有14例，在31例Ang-2阳性表达者中VEGF同时为阳性的有21例(χ2=6.95，P<0.01)。经相关分析显示，在胃癌组织Ang-2表达与VEGF表达呈正相关(r=0.846，P<0.01)。
3讨 论(成旭惠 欧希龙 颜 芳 关云艳 杨 柳 宋永谦)
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