大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经细胞样细胞分化(2)
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1.2BMSCs的培养和纯化
取SD大鼠1只,100g•L-1 水合氯醛麻醉后体积分数75%乙醇浸泡3 min,于超净工作台上严格无菌条件下取大鼠双下肢,剪除软组织,留取股骨和胫骨。将骨骺端剪去,暴露两端骨髓腔,使用5ml注射器抽取DMEM培养液反复冲洗骨髓腔,冲洗液收集于无菌离心管中,1000 r•min-1 离心5min 。弃去上清液,加入体积分数20%血清培养液,充分吹打至单细胞悬液,调细胞浓度为4×108个•L-1,接种于培养瓶中。置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。4d后全量换液,去除未贴壁细胞。以后每3d换液1次,待细胞长至80%～90%融合后,用含0.25 g•L-1 胰酶的消化液消化,以细胞密度4×108个•L-1 接种传代。
1.3诱导和分化
传至第3代MSCs按1×104个•ml-1浓度接种于6孔板中,培养液改用DMEM加20%胎牛血清,待细胞融合达90%后,分为A、B、C3组。预诱导24h后，A组加入EGF、bFGF和RA联合诱导剂(终质量浓度为300ng•L-1) ......
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