应用背向散射积分技术评价糖尿病大鼠心肌纤维化(2)
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参见附件(3237KB，6页)。
1 材料与方法
1.1 糖尿病大鼠模型的制备及分组
8周龄SPF级健康雄性SD大鼠50只(购自北京维通利华实验动物中心),体重180～210 g,平均(199.64±11.04) g。抽签法随机选取32只按65 mg•kg-1腹腔注射链尿佐菌素(streptozotocin,STZ,Sigma公司)。注射后3 d及7 d,断尾法用ACTIVE血糖仪(上海罗氏医药公司)测血糖,将血糖稳定大于16.7 mmol•L-1、尿糖持续阳性者定为糖尿病大鼠模型(DM组)。除去未成模4只及死于急性并发症大鼠10只,余下的18只随机分为4、12、24周组,每组6只,同时随机选取同周龄大鼠各6只作为正常对照(CN)组。
1.2 超声检测
大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg•kg-1)麻醉后取左侧卧位,应用HP-SONOS-5500超声诊断仪,S8探头,于M型超声下检测左心室波群并测量大鼠左室舒张内径(Dd)、收缩末期内径(Ds),计算左室射血分数(LVEF)。启动声学密度(AD)定量系统,调节深度(2～3 cm)、总增益、时间补偿增益及侧方增益补偿,获得满意的左室长轴及乳头肌水平左室短轴切面,将连续2.48 s内62帧图像存入磁光盘。感兴趣区(ROI)置于左室后壁中间段的心肌层及心腔内,随心动周期运动。测得以下参数:峰-峰强度(PPI,即背向散射积分周期变化值,CVIB),平均图像强度(AII,即IBS),图像背向散射标准差(SDI)。心肌校正IBS(IBS%)=心肌层IBS值/心腔血流IBS值。
1.3 标本采集
腹主动脉放血处死动物,立即取左室心尖部1 mm×1 mm×2 mm左右心肌组织2块,放入2.5%戊二醛中,保存于4 ℃冰箱,用于电镜观察。将心脏自心尖部至心底部横断为3份,取中间段放入10%中性福尔马林中固定,做好标记,用于组织形态学观察(Masson三色染色、免疫组织化学染色),另2份放入做好标记的冻存管中,并立即投入液氮中,然后转移至-70 ℃冰箱,用于心肌羟脯氨酸(HPC)检测。
1.4 心肌HPC浓度测定
试剂盒购自南京建成生物技术公司。碱水解法进行前处理,用722可见分光光度计测550 nm处各管吸光度值,计算HPC。
1.5 Masson三色染色法进行胶原染色
应用Masson三色染色法对心肌进行染色(试剂盒购自福州迈新生物技术公司),胶原纤维呈蓝色,心肌细胞呈红色。用图像采集系统(Olympus公司)采图,Motic Med数码医学图像分析系统计算心肌胶原容积分数(CVF)和血管周围胶原面积(PVCA)。CVF=胶原面积/总面积,其中胶原面积不包括血管周围胶原面积;PVCA=壁内小动脉管腔周围胶原面积/该小动脉管腔面积。每组取12张切片,每张切片随机取5～10个200倍显微视野图像。
1.6 免疫组化染色测定胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的表达
石蜡切片,TGF-β1采用柠檬酸高压抗原修复,胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ采用复合消化液酶修复,分别滴加抗兔胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ(武汉博士德生物制品公司)稀释一抗(1∶100),放入4 ℃冰箱过夜。再滴加生物素化山羊抗兔IgG和试剂SABC,DAB显色。每组取12张切片,每张切片随机取10～15个200倍显微视野图像,测定平均积分光密度(intergrated optical density,IOD)。
1.7 透射电镜标本制备
心肌组织脱水,浸透聚合。行超薄切片并用2%醋酸铀及枸橼酸铅染色,透射式电子显微镜(日立H-7650)观察摄片。
1.8 统计学分析
所有数据均以x-±s表示,应用SPSS 12.0软件包进行统计学分析。各组间比较采用随机区组设计的方差分析,相关性用线性相关分析。
2 结果
2.1 大鼠一般情况观察
与CN组比较,DM组明显消瘦,多饮、多尿,精神萎靡,活动减少,毛发枯黄、无光泽,第6周出现白内障。
2.2 超声指标变化
各组大鼠LVEF未发现明显差异(P>0.05)。IBS% DM组明显高于CN组(P<0.05),且随鼠龄增加逐渐升高,见表1。CVIB和IBS 12周时未见明显差异(P>0.05);24周时CVIB CN组为6.3,DM组明显降低(4.1),IBS CN组为18.7,DM组明显升高(22.5),两组比较均有显著性差异(均P<0.05)。见图1。
HPC为羟脯氨酸,CVF为心肌胶原容积分数,PVCA为血管周围胶原面积
与CN组比较,*P<0.05;与DM 4周组大鼠比较,△P<0.05,与DM 12周组比较,#P<0.05
2.3 HPC测定和Masson染色胶原形态定性分析
HPC含量DM组明显高于CN组(P<0.05)。Masson染色各CN组胶原主要沉积在小动脉外膜,在心肌间质中较少;DM组血管周围胶原增密,在心肌间质中明显增多。DM组大鼠的CVF、PVCA均显著高于CN组(均P<0.05)。见图2。
2.4 心肌组织中胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的表达
DM组Ⅰ型胶原主要在细胞间质呈线状分布,随病程进展表达呈束状;Ⅲ型胶原主要在细胞间质和胞浆分布,在血管平滑肌细胞亦有表达,横切面上多表现为散在的斑块。与CN组比较,DM各组表达均明显增加(P<0.05)。见图3、4。
2.5 超微结构观察
CN组心肌细胞肌原纤维丰富,肌丝排列整齐,线粒体嵴排列有序,可见成纤维细胞和少量胶原微纤维 ......
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