急性髓系白血病中Nras基因点突变的检测以及信号传导通路蛋白的表达(2)
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1.3 实验方法
1.3.1 标本采集 用预先肝素化的无菌注射器取AML患者及对照组骨髓液3～5 ml,使用淋巴细胞分离液(Ficoll液)分离骨髓单个核细胞(MNC),保存于-70 ℃或者直接提取DNA和蛋白。HL-60及K-562细胞株待培养到稳定对数生长期,分别取1×107数量级的细胞提取DNA和蛋白。
1.3.2 PCR-SSCP法 PCR反应总体积为50 μl体系,含有TaKaRa Taq酶0.25 μl,10×PCR Buffer 5 μl,Mgcl2(25 mmol•L-1)3 μl,DNTP Mixture(各2.5 mmol•L-1)4 μl,模板DNA4 μl,引物(20 U)各1 μl,加灭菌蒸馏水至50 μl。反应条件为:(1)94 ℃预变性10 min,(2)依次94 ℃变性60 s,52 ℃退火40 s,72 ℃延伸60 s,共35个循环。(3)72 ℃延伸10 min。产物置于4 ℃保存。PCR产物10 μl加入变性缓冲液(95%甲酰胺,10 mol•L-1 medta,0.02%溴酚蓝)10 μl,加热煮沸6 min,立即置于冰浴中冷却至少5 min ......
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