不同剂量致敏原对小鼠哮喘模型气道反应性的影响(2)
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[Key words] mice model of asthmac; ovalbumin; airway responsiveness; BALF
BALBC小鼠哮喘模型是经典的哮喘动物模型之一,哮喘模型中最常用的致敏原是鸡卵蛋白(OVA)。有研究报道致敏原的剂量是影响小鼠哮喘表现型的一个重要因素,最近国外报道抗原剂量的不同是影响Th细胞向Th1、Th2分化的决定性因素[1]。目前许多小鼠哮喘模型制作中所用到的OVA致敏的剂量不等[2-4],有学者通过检测细胞因子IL-4、IL-5、IL-12、IFN-γ的含量变化发现,10 μg OVA的致敏剂量是最有效的[5-6],但对于不同剂量的致敏原是否对气道高反应性有影响,国内外尚无报道。本实验通过两种不同剂量的致敏原,观察哮喘动物模型的无创气道反应性是否有区别,为规范小鼠哮喘模型的精确建立提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物 SPF级雌性BALB/c小鼠30只,4～6周龄,体质量18～20 g,由南方医科大学实验动物中心提供,可以自由进食去卵白蛋白(不含鸡蛋)的饲料和水。
1.1.2 主要试剂和仪器 卵蛋白(OVA)：美国Sigma公司产品；超声波雾化器：广东粤华牌WH-2000型产品；小鼠IgE酶联免疫分析试剂盒和小鼠IFN-γ联免疫分析试剂盒：美国R & D公司产品；小鼠无创肺功能仪：美国Buxco公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组 30只SPF级雌性BALB/c小鼠随机分为A、B、C 3组(A组为10 μg OVA哮喘组,B组为2 mg哮喘组,C组为正常对照组),每组10只。
1.2.2 模型的制备 A、B组于开始、第14天给予小鼠腹腔注射含OVA和乳化的氢氧化铝[Al(OH)3]的生理盐水混悬液致敏(A组每只小鼠每次给予含OVA 10 μg+Al(OH)3 5 mg的生理盐水混悬液200 μl,B组每只小鼠每次给予含OVA 2 mg+Al(OH)3 5 mg的生理盐水混悬液200 μl)。于第21天开始对A、B组小鼠均给予1%OVA生理盐水滴鼻,每天1次,每次滴100 μl,滴鼻完后进行雾化激发(雾化液为2%OVA生理盐水40 ml,每天1次,每次持续约30 min,连续6 d)。正常对照组于开始、14天给予只含Al(OH)3的生理盐水混悬液,每只每次给予含Al(OH)3 5 mg的生理盐水混悬液200 μl致敏。于第21天开始对小鼠给予生理盐水滴鼻、雾化激发,方法同哮喘组。
1.2.3 记录小鼠活动情况 第二次致敏后及雾化过程中观察小鼠是否出现喘息、呼吸困难、躁动(速发相反应)、口唇、双眼及耳紫绀,尿便失禁、双肺闻及哮鸣音等表现。
1.2.4 肺功能检查 末次激发24 h后,各组随机取3只小鼠，采用Buxco小鼠无创肺功能仪测定小鼠的气道反应性。以小鼠雾化吸入0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg•ml-1倍增质量浓度的乙酰甲胆碱Mch下测定相应浓度下的增强呼气间歇(Penh)值。Penh值越高,气道反应性越高。
1.2.5 外周血 各组小鼠最后一次激发24 h内,将眼周皮肤往颈后拉,使眼球突出充血,用镊子迅速夹去眼球,同时将小鼠头向下,使血液滴入含抗凝剂的EP管内,以3 000 r•min-1离心5 min,取上清液,置于-20 ℃保存备用。
1.2.6 肺泡灌洗液(BALF) 处死小鼠,暴露其颈前气管,用中心静脉留置针行气管插管,0.3 ml PBS行支气管肺泡灌洗3次,回收率在80%以上。BALF离心后取上清液,-20 ℃保存备用。BALF中细胞沉淀用PBS重悬后测定细胞总数,另嗜酸粒细胞稀释液稀释5倍后,用细胞计数板在低倍镜下计数。
1.2.7 肺组织病理学观察 将左肺上叶分离,4%多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋,切片,HE染色后行肺组织病理观察。
1.2.8 采用ELISA法测定血浆、BALF中IgE和IFN-γ的水平 操作方法按小鼠IgE、IFN-γ的ELISA试剂盒说明书操作。
1.3 统计学处理
数据以±s表示。采用SPSS 13.0统计学软件。多个样本间比较行单因素方差分析；两组间样本均数的比较行t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 小鼠被第二次致敏后及雾化激发时的表现
哮喘B组在第二次致敏后15 min后出现呼吸急促,口唇、耳、尾巴黏膜发紫,持续2～3 h(图1)，哮喘B组较哮喘A组明显；正常对照组致敏后无明显异常表现。哮喘A、B组在雾化激发时出现喘息、扭体、口唇、耳、尾巴紫绀等表现；正常对照组无异常表现。
2.2 3组小鼠气道反应性
结果见图2。哮喘A组从Mch质量浓度为6.25 mg•ml-1开始,其Penh值明显高于正常对照组(P<0.01)；哮喘B组从Mch质量浓度为3.125 mg•ml-1开始,其Penh值明显高于正常对照组(P<0.01)。哮喘A组与哮喘B组的Penh值相比较,在Mch质量浓度为0和3.125 mg•ml-1时,两者比较差异无统计学意义；从6.25mg•ml-1开始时哮喘B组的Penh值明显高于哮喘A组(P<0.01)。
2.3 3组肺组织病理学检查
结果见图3。哮喘A、B组小鼠的支气管、血管周围,肺间质及肺泡腔内可见嗜酸粒细胞、淋巴细胞浸润,气道上皮损伤,结构紊乱,气道内杯状细胞肥大增生,气道内分泌大量黏液并有黏液栓形成。正常对照组肺组织气道结构清晰,气道纤毛上皮排列整齐,无明显的炎症改变。
2.4 BALF中细胞总数、嗜酸粒细胞计数
结果见表1。哮喘组BALF中的细胞总数、嗜酸粒细胞数较正常组的增多,差异有统计学意义(P<0.05)；哮喘B组BALF中的细胞总数及嗜酸粒细胞数与哮喘A组的相比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。
3 讨 论
支气管哮喘是一类以肺内嗜酸粒细胞聚集、黏液过度分泌、IgE升高、气道高反应性为特点的疾病,由于哮喘气道炎症和气道反应性改变往往并不一致,即气道内存在炎症细胞但并不一定有气道功能改变,肺内无嗜酸粒细胞浸润但并不一定无气道高反应(AHR) ......
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