丙基硫氧嘧啶不同摄入方式对大鼠动脉粥样硬化形成的影响(2)
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1.3.3 动物饲养 空白对照组使用基础饲料喂养；A组：给予动物一次性腹腔注射维生素D3 6×105 U•kg-1,腹腔注射前禁食禁水8 h,随后给予高脂饲料A喂养；B组：给予动物一次性腹腔注射维生素D3 6×105 U•kg-1,腹腔注射前禁食禁水8 h,丙基硫氧嘧啶按每日每只大鼠进食量的0.2%灌胃给药,高脂饲料B喂养。整个实验周期90 d。
1.4 血液和动脉标本的采集
实验第90天,各组动物禁食过夜,戊巴比妥钠30 mg•kg-1腹腔麻醉后,分离右侧股动脉,离断该处动脉取血。待血液凝固后以3 000 r•min-1离心15 min,分离出血清,取1 ml用于血总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)的检测。分离主动脉至髂总动脉分叉处,取主动脉弓、胸主动脉全段及腹主动脉段，立即用10%中性福尔马林钙溶液(10%中性福尔马林溶液100 ml加氯化钙1 g)固定,用于常规形态学检查。
1.5 血脂的检测
用全自动生化分析仪(BECKMAN COULTER SYNCHRON clinical system LX20)检测血脂,在东南大学附属中大医院检验科完成。
1.6 动脉壁整体标本油红O染色
(1) 将固定好的整体大动脉标本取出,充分水洗4 h后剪开,剥去动脉壁的外膜；(2) 将标本入60%异丙醇溶液中浸10 min；(3) 入油红O染液中浸染,室温3～4 h；(4) 入60%异丙醇或70%乙醇中分化,更换6～7次分化液,直到动脉粥样硬化斑块成红色,而动脉壁则呈白色为止；(5) 自来水冲洗终止分化。肉眼观察并摄片。
1.7 HE染色
将用10%中性福尔马林溶液固定的主动脉石蜡包埋,连续切片,切片固定于载玻片上,HE染色,光镜观察。
1.8 统计学处理
实验数据以±s表示。使用SPSS 13.0统计软件分析数据。多组间的均数两两比较采用One-way ANOVA,样本率的比较采用Exact Probability Method,显著性水平设定为P=0.05。
2 结 果
2.1 一般状况
实验过程中共有4只大鼠死亡,其中A组于建模后期死亡4只,死亡率为40%,死亡动物予以解剖,未见动脉粥样硬化改变出现。B组、空白对照组均无死亡。实验发现,空白对照组大鼠的体质量随饲养的时间延长而逐渐增加,A组和B组大鼠的体质量在最初20 d增长,中间40 d进入平台期,后30 d有明显下降,但A、B组间体质量差异无统计学意义(表1)。
与空白对照组比较,a P<0.01；与A组比较,b P=0.366,即A组与B组的动脉粥样硬化形成情况的差异无统计学意义
A、D.空白对照组；B、E.A组；C、F.B组。上排为油红O染色,下排为HE染色(×200)
图1 3组大鼠动脉病理形态学比较
2.3.2 HE染色结果 空白对照组大鼠动脉的内膜、中膜和外膜分界清楚,管腔面由单层内皮细胞覆盖,细胞完整,中膜主要见弹力纤维和梭形平滑肌细胞,外膜较薄,为疏松结缔组织(图1D)。与空白对照组相比,A组大鼠中,6只大鼠均表现为动脉内膜增厚,内膜下可见平滑肌细胞、泡沫细胞聚集,未见典型的粥样斑块形成(图1E)。B组大鼠中,8只大鼠血管内皮呈连续性破坏,管壁局部向管腔明显突出,形成斑块,斑块内有坏死物质形成,弹力纤维断裂,可见大量胆固醇结晶和钙盐沉积,动脉外膜变薄撕裂,呈较典型的粥样斑块的改变(图1F)。
3 讨 论
建立合适的动脉粥样硬化动物模型是研究其发病机制及探讨治疗措施的重要条件。在常用的实验动物中,猴和猪是研究AS的理想实验动物,但由于购买和维持费用的昂贵,难以作为模型使用[7]。食草性动物如家兔,其对高脂饲料有易感性,但所形成的斑块的突出特点是大量脂质聚集形成的软脂质斑块,不同于人类的以大量钙质的沉着为特点之一的复杂斑块[8]。大鼠虽具有抗动脉粥样硬化特性,但其属杂食类动物,易获得、易饲养,生理解剖与人类相似,可用于实验研究的抗体种类丰富,因此大鼠动脉粥样硬化模型仍具研究价值。
大量实验与临床资料证明，高脂血症是AS形成的主要危险因素[9]。同时有报道表明，大剂量的维生素D3可以诱发动脉壁钙化[10],且此过程可被钙拮抗剂所逆转[11],但此种动物模型大动脉改变以钙沉积为主,脂质沉积少见。因此,有学者用高脂饲料联合维生素D3做食饵来诱发大鼠动脉粥样硬化[12]。温进坤等[13]采用大剂量维生素D3及高脂饲料饲喂大鼠24 d,发现模型大鼠血清胆固醇及甘油三酯水平显著升高,动脉内膜细胞增生出现斑块状突起,中膜可见明显的钙化、平滑肌细胞增生及泡沫样细胞。杨军珂等[14]采用肌注维生素D3与球囊损伤主动脉内皮加用高脂饲料联合饲喂大鼠的方法,使大鼠主动脉上形成了较典型的动脉粥样硬化斑块。但球囊损伤内皮法对技术要求高,且大鼠易发生感染而导致死亡,操作复杂,难以推广。
由于大鼠无胆囊,单纯用含胆固醇的饲料喂养不易使大鼠血清胆固醇增高,不易形成AS病变。因此很多学者在高脂饲料配方中,增加了胆酸钠和丙基硫氧嘧啶,前者能显著增加胆固醇吸收量,后者使甲状腺功能低下,最终使TC和LDL增高,HDL降低。
在前期实验中,本组参考其他学者的方法,用维生素D3联合添加丙基硫氧嘧啶的高脂饲料饲喂法诱导动脉粥样硬化模型,但发现动物进食少且死亡率高,动脉壁难以形成典型病变,实验结束所得有效动物太少。我们推测大鼠因丙基硫氧嘧啶味极苦而拒食饲料,导致体质量急剧下降、抵抗力减弱,易罹患肺炎而死亡；同时因进食高脂饲料量少,导致建模效果不稳定。为了证实我们的推断,本实验采用丙基硫氧嘧啶饲喂和灌胃两种给药方法进行建模并比较。
实验结果显示,高脂饲料B组动物血清TC、LDL水平明显高于高脂饲料A组,且这两组动物血清TC、LDL水平均明显高于空白对照组；另外,A、B两组动物的血清TG水平与空白对照组无差异,可能是由于维生素D3能促进肠道钙的吸收,因而影响脂质的吸收和血脂水平,维生素D3的这种作用受其剂量及饮食中脂质含量的影响如何,尚待进一步研究。病理检查显示,A、B组大鼠均出现动脉粥样硬化改变,其中B组病变较A组严重 ......
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