荧光实时定量ＲＴ—ＰＣＲ观察伤寒杆菌鞭毛ｚ66和 ｄ／ｊ抗原基因表达方法的建立
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[摘 要] 目的：构建荧光实时定量RT-PCR测定伤寒杆菌鞭毛抗原z66和d/j编码基因mRNA的方法。方法：根据伤寒杆菌鞭毛抗原：66和d/j编码基因序列，设计引物扩增其读码框架内片段，克隆进pCEM-TEasy质粒。质粒经 PCR鉴定后，纯化并定量，作为荧光实时定量PCR的标准品，并制作标准曲线。利用不同渗透压下的鞭毛素基因表达差异，比较三种随机引物(6、8、10核苷酸)与特异性引物的逆转录效果，以确定一种最佳的随机引物用于多基因表达观察。结果：标准曲线有较好的线性(r＝0.999)，cDNA和标准品的PCR产物溶解曲线峰值一致。用8核苷酸随机引物进行逆转录的敏感度高于6、10核苷酸随机引物，低于特异性引物，但用其观测z66抗原基因和d/j抗原基因在高、低渗时表达变化趋势与用特异性引物测得结果一致。结论：成功构建用8核苷酸随机引物进行逆转录同时测定伤寒杆菌鞭毛抗原z66和d/j基因表达的荧光实时定量RT—PCR方法。
[关键词] 实时荧光定量RT—PCR；伤寒杆菌；随机引物
[中图分类号] R331
[文献标识码] A
[文章编号] 1671—7783(2005)01—0021—04
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