流式细胞仪测定血小板胞浆游离钙浓度
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摘要：目的 建立流式细胞仪测定血小板胞浆游离钙离子浓度\[Ca2+\]i的方法。方法 用Fluo 3AM作为钙指示剂，在有或无细胞外钙\[Ca2+\]o存在的条件下，测定静息和凝血酶激活状态下人血小板胞浆游离钙离子浓度\[Ca2+\]i的变化。结果 Fluo 3AM标记的血小板的平均荧光强度明显增加。凝血酶使负载Fluo 3AM标记的血小板胞浆\[Ca2+\]i明显增加，且显示剂量依赖和对\[Ca2+\]o的依赖。结论 凝血酶引起血小板胞浆\[Ca2+\]i增加的来源主要是\[Ca2+\]o，可能也有部分是内钙释放的参与。
关键词：流式细胞仪；血小板；钙；凝血酶
Determination of the level of cytoplasmic free calcium
in human platelets with flow cytometry
Zhuang Mingming, Wen Yixin, Liu Shaolie, Hong Xiaopeng
(Department of Clinical Laboratory of Overseas Chinese Hospital, Puning 515300, China)
ABSTRACT: Objective To set up a method to determine cytoplasmic free calcium \[Ca2+\]i in human platelets with flow cytometry. Methods As a calcium indicator, Fluo 3AM was used to determine the changes, induced by thrombin, of the level of platelet plasma free calcium \[Ca2+\]i in presence or absence of outside calcium \[Ca2+\]o, in order to elucidate where the platelet plasma free calcium \[Ca2+\]i mainly come from and its role in the activity of platelets. Results The geometric mean of fluorescence intensity of the platelet, labeled with Fluo 3AM, was increased obviously. The concentration of platelet plasma free calcium \[Ca2+\]i was increased significantly by thrombin in a dose and \[Ca2+\]odependent manner. Conclusion The increased level of platelet plasma free calcium \[Ca2+\]o, induced by thrombin, mainly comes from \[Ca2+\]o and partly from the released \[Ca2+\]o of intraplatelet probably.
KEY WORDS: flow cytometry; platelet; calcium; thrombin
血小板胞浆游离钙离子\[Ca2+\]i与血小板的许多形态与功能活动有关，如血小板形态的改变、聚集、收缩、释放、分泌等。也与血小板参与的凝血、血液流变性调节(如血液黏度、流动性等)以及动脉粥样硬化、脑血管疾病的发生和发展、血管内皮活动等生理、病理过程有关。研究发现\[1\]，当血小板内的\[Ca2+\]i达到一定的阈值(400nmol/L)就会发生释放反应以及可逆性聚集。达到另一个阈值(800nmol/L)，就会发生不可逆性聚集。因此，研究血小板胞浆游离钙浓度的变化，对阐明血小板参与和调节的许多生理生化以及病理过程有重要意义。人们常用钙荧光指示剂(水母素、Quin2、fura2、Fluro 2AM、Fluo 3Am)和双波长荧光光度术测定细胞胞浆游离钙浓度\[2-4\]。本文在建立流式细胞术法测定血小板胞浆游离钙浓度的基础上，研究了凝血酶诱导的人血小板胞浆游离钙浓度的变化。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 血液样本
成人血样，男女兼有，1个月内没有服用阿司匹林及其他影响血小板功能的药物。空腹肘静脉采血，用ACD(ACD∶血 = 1∶6)抗凝。
1.1.2 药品与试剂
Fluo 3AM(溶于DMSO中)、EGTA(溶于超纯度去离子水中)、Triton X100、ADP、凝血酶、小牛血清白蛋白(BSA)，均为Sigma(USA)公司产品。ACD(mmol/L：枸橼酸 7, 枸橼酸三钠 85，葡萄糖 100)。Hepes缓冲液(mmol/L: NaCl 145, KCl 5, MgSO4 1.0,Hepes 10, Na2HPO4 0.5, 葡萄糖 10, pH7.4)。CaASAHepes缓冲液(在Hepes缓冲液中加入120mmol/L CaCl2 和0.94mmol/L ASA，pH7.4)。CaHepes缓冲液(在Hepes缓冲液中加入120mmol/L CaCl2 ，pH7.4)。其他试剂均为市售产品。
1.1.3 主要仪器
FACSCalibur型流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 富血小板血浆(PRP)制备
抗凝血200×g离心10min，取上清即得富血小板血浆(PRP)。
1.2.2 负载Fluo 3AM血小板悬液制备
取PRP，加入乙酰水杨酸(ASA)，使终浓度为0.94mmol/L。轻轻摇匀后800×g离心10min，弃上清。取沉淀的血小板，加入CaASAHepes缓冲液1mL，800×g离心10min，弃上清。取沉淀的血小板，加入CaASAHepes缓冲液重悬血小板，调节血小板浓度为2×109/mL。在血小板悬液中加入BSA(终浓度为1.5g/L)和Fluo 3AM(4.0μmol/L)，轻摇混匀后，在37℃水浴孵育30min后，800×g离心10min，弃上清，用1mL CaHepes缓冲液重复2次，洗去溶液中多余的Fluo 3AM。用Hepes缓冲液重悬血小板，调节其浓度为2×106/mL。
1.2.3 流式细胞仪测定血小板胞浆\[Ca2+\]i
取负载Fluo 3AM的血小板悬液0.5mL，加入3mL聚乙烯试管中，用CellQuest软件获取和分析数据，激发波长为488nm，测定时，用侧向角(SSC)F1(Fluo 3AM)散点图识别血小板，用F1直方图测定平均荧光强度。每个样本获取10000个血小板。用Crykiewicz G\[5\]的等比值法公式计算出血小板胞浆\[Ca2+\]i：\[Ca2+\]i＝Kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)式中Kd是Ca2+结合Fluo 3AM的解离常数，为204nmol/L(37℃)。F为各样本荧光强度的测定值。Fmax和Fmin分别是最大荧光强度和最小荧光强度的测定值。
最大荧光强度和最小荧光强度的测定：在各试管中加入60g/L Triton X100、5mmol/L CaCl2，摇匀，静置10min，用流式细胞仪测定平均荧光强度，此乃最大荧光强度。用无钙的Hepes缓冲液重悬血小板，调其浓度为2×106/mL，加入25mmol/L EGTA(钙特异性络合剂)，摇匀，静置10min，用流式细胞仪测定平均荧光强度，此乃最小荧光强度。
1.2.4 凝血酶对血小板胞浆\[Ca2+\]i的影响
分别研究缓冲液中有钙和无钙存在时，凝血酶对血小板胞浆游离钙浓度的影响。在CaASAHepes缓冲液和无钙的Hepes缓冲液中加入凝血酶10、100、1000U/L，用此缓冲液制备负载Fluo 3AM的血小板悬液，用流式细胞仪测定10000个血小板的平均荧光强度。为了观察血小板\[Ca2+\]i 随时间的变化，分别在加入凝血酶后5、10、15min时各测定一次。
〖2〗西安交通大学学报(医学版)〖3〗第26卷5期〖2〗庄明明，温奕欣，刘少列，等. 流式细胞仪测定血小板胞浆游离钙浓度1.3 统计学方法 所用数据用±s表示，用SPSS 10.0 version 软件和tstudent test法统计分析实验结果。
2 结果
2.1 人血小板胞浆\[Ca2+\]i
将样本放置在样本架上，按下“run”按钮，开始获取数据，以未标记荧光素的样本为空白对照，并用它调整阴性区域的位置，然后依次测定各个样本。结果见图1。
2.2 在外钙\[Ca2+\]o存在时凝血酶刺激对人血小板\[Ca2+\]i的影响
在1mmol/L \[Ca2+\]o存在时，血小板静息\[Ca2+\]i为(108.9±10.5)nmol/L(n= 8)，在加入10、100、1000U/L凝血酶后，血小板\[Ca2+\]i明显上升，而且有明显的剂量依赖关系(表1)。100U/L凝血酶可以使 \[Ca2+\]i增加6.4倍。5min时，血小板\[Ca2+\]i水平较开始加入凝血酶时降低，10min时接近于静息水平。
2.3 无外钙\[Ca2+\]o存在时人血小板\[Ca2+\]i对凝血酶刺激的反应
在缓冲液中没有钙存在的情况下，血小板的 \[Ca2+\]i为(29.5±5.6)nmol/L(n= 8)，缓冲液中凝血酶的水平为10、100、1000U/L时，血小板 \[Ca2+\]i的水平有所上升，但上升的程度明显小于有外钙时。100U/L凝血酶使血小板 \[Ca2+\]i增加1.3～1.5倍，并在5min时恢复到静息水平(表1)。表1 有或无\[Ca2+\]o时凝血酶对血小板\[Ca2+\]i的影响(略)
3 讨 论
本实验使用的Fluo 3AM为细胞可通透的细胞内钙荧光指示剂，在没有水解前和(或)无Ca2+存在时，不显示荧光，低亲和性结合测量到的瞬间Ca2+峰值比Fura 2的高\[6\]。Triton X100 能增加细胞膜通透性，提高胞浆内Ca2+的浓度，因此，用它测定胞浆内Ca2+饱和浓度。EGTA\[Ethylene lycolbis(2aminoethylether)-N,N,N′,N′tetraacetic acid\]是镁存在时测定钙浓度的鳌合剂\[7\]，也是有效的金属蛋白酶的抑制剂\[8\]，在测定最小荧光强度时，用EGTA络合胞浆内的Ca2+，使胞外的Ca2+浓度最低。ASA(乙酰水杨酸)是血小板稳定剂，可以防止血小板聚集，并保证血小板的功能完善。
血小板静息\[Ca2+\]i是指没有任何刺激存在时，血小板胞浆的游离钙浓度。实验结果显示，\[Ca2+\]o 为1mmol/L时，人血小板的静息\[Ca2+\]i为(108.9±10.5)nmol/L；\[Ca2+\]o为0mmol/L时，其静息\[Ca2+\]i为(29.5±2.6)nmol/L。在血小板缓冲液中加入凝血酶后，血小板\[Ca2+\]i迅速上升，而且有明显的剂量依赖关系。\[Ca2+\]o 为1mmol/L时，0.01、0.1、1.0U/mL的凝血酶使血小板内游离钙浓度分别上升1.58、6.42和10.05倍。另外，\[Ca2+\]o为0mmol/L时，凝血酶也使\[Ca2+\]i有所提高，但提高的幅度明显减少，如0.01、0.1、1.0U/mL的凝血酶使血小板内游离钙浓度分别上升0.13、1.3和2.5倍。结果说明，血小板\[Ca2+\]i的高低与\[Ca2+\]o存在与否有密切关系。而且在凝血酶的刺激存在时，\[Ca2+\]i提高的程度也与\[Ca2+\]o有密切关系。提示血小板内钙的升高主要依赖于\[Ca2+\]o的存在，但不排除内钙释放的参与\[9,10\]。
流式细胞术在生物医学和分子生物学研究领域的广泛应用，大大推进了相关学科的发展。结合荧光探针技术，对细胞表面抗原、荧光蛋白表达、DNA含量及其细胞周期、细胞凋亡等进行大量、多参数检测与分析，是流式细胞术的特点。我们应用Fluo 3AM和流式细胞术测定血小板\[Ca2+\]i，因为Fluo 3AM很容易进入细胞，荧光强度高，操作方法简单易行，测量灵敏度高，重复性好，是研究细胞内\[Ca2+\]i的有效方法。
参考文献：
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作者简介：庄明明(1941)，男，广东普宁人，副主任检验师.
(广东省普宁市华侨医院检验科，广东普宁515300)
(编辑 邱芬)
收稿日期：20050530
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