兔肾ＶＸ2移植瘤模型的建立及其超声显像检测
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摘要：目的 比较建立兔肾VX2移植瘤模型的不同方法的优劣。方法 分别用瘤液穿刺法、瘤块液种植法、瘤块包埋法建立兔肾VX2癌模型。采用超声技术动态检测肿瘤体积及CDFI的变化，确定该模型最佳实验干预时段及其血流参数范围。比较各自的成瘤率；观测肾脏肿瘤的大小及其回声、瘤内血管生成以及血流阻抗等指标。结果 瘤块包埋法可建立稳定的兔肾VX2移植瘤模型。B超可以实时、准确、方便的监测肿瘤体积及血流动力学变化。结论 兔肾VX2移植瘤是一种造模方法简便且成瘤率高的肾癌动物模型，采用超声技术能精确、无创的动态监测肿瘤体积变化及血流特征。
关键词：兔；VX2肾癌；超声技术
Establishing rabbit VX2 carcinoma model and monitoring it with color Doppler energy ultra sound technique
Wang Ziming, She Junjun, Cheng Wei, Li Xiaopeng, Li Qian, Che Xiangming, Han Shuiping, Bai Zhuoya
(Department of Urology, Second Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004;Department of General Surgery, First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061;Department of Ultrasonic Diagnosis, Second Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004;Department of Pathology, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061; Wugong County Hospital, Shaanxi Wugong 712200, China)
ABSTRACT: Objective To compare the advantages and disadvantages of several methods to establish the rabbit VX2 carcinoma model. Methods Ultrasound technique was used to confirm the best periods of experiment on the rabbit VX2 carcinoma mode. The rabbit VX2 carcinoma model was established by different ways, such as tumor cells fluids and tumor block transplanting guided by Bultrasound, tumor block transplanting by operation to compare their successful rate. Kidney size and other indexs were observed. Results Tumor block transplanting by operation was the most successful to establish a steady model. Conclusion The rabbit VX2 carcinoma is one of the biggest animal models for kidney carcinomas experimental research; it is steady and easy to be manipulated.
KEY WORDS: rabbit; VX2 kindey carcinoma; B ultrasound
小鼠移植瘤模型常被用于肾癌的实验研究，但动物体型小、抗干预能力差，肿瘤原发部位不在肾脏并且成瘤率低，因而其应用受到限制。VX2肿瘤是由Shope病毒诱发的兔可移植性肿瘤，可接种到不同器官而成兔移植瘤模型。我们旨在寻找建立兔肾VX2移植瘤模型的最佳方法，用B超追踪肿瘤生长特征，确定最佳实验干预时段，为评价肾癌的基础研究及治疗疗效提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料 新西兰大白兔45只，体质量2.0-2.5kg，雌雄不限，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。VX2瘤株由第四军医大学提供。B超检查用美国Acuson 512 型彩色多普勒超声诊断仪。日本Hitachi H600型电子透射显微镜。
1.2 VX2瘤细胞的复苏与培养 按照一般细胞培养技术对冰冻VX2瘤细胞悬液进行复苏后离心5min(800r/min)，除去上清液，加入PBS液用玻璃棒搅匀。取悬液置于RPMI1640培养液中，台盼蓝染色并做死、活细胞计数，将培养液调制成107/mL活细胞浓度。
1.3 动物模型建立 将45只兔随机分为A、B、C 三组，每组各15只。A组采用瘤细胞悬液接种法。兔清醒状态下B超引导穿刺右肾下级并注入瘤细胞液1mL。B组采用瘤块液穿刺种植法。先将上述瘤细胞液2mL分别注入兔双侧后腿皮下即成为荷瘤种兔，两周后肿瘤形成直径约2cm大小时完整切取，去除包膜及坏死组织，剪取肿瘤边缘生长旺盛部分置于Hanks液中。尽量剪碎约1mm，制成瘤细胞悬液。兔麻醉状态下B超引导16G穿刺针进入右肾下级，注入瘤细胞悬液0.3mL。C组采用瘤块包埋法。兔麻醉后俯卧位固定，取右12肋缘下切口3-4cm，暴露右肾下级后用眼科镊穿刺1.5cm深隧洞。在冰块上将前述荷瘤组织剪为直径0.2-0.3cm的小块后植入。明胶海绵压迫止血，生物胶填塞。各组操作均于1.5h内完成。实验动物肌注青霉素40万单位，连续3d。实验期内无1例兔感染或死亡。
1.4 肿瘤的超声检查 用Acuson Sequoia512 型超声仪，15L8W宽频线阵探头(频率为8.0-13.0MHz),分别于肿瘤种植后7、9、11、13、15、17、19、21、23、25d对实验兔进行多切面扫查，由两名高年资超声医师同时操作。观察肾脏及肾内肿瘤的大小、形态、回声特点,用所测数据计算肿瘤体积(V=0.5a×b2，a和b分别是肿瘤最大直径和与其垂直的最小横径)和肿瘤生长率(tumor growth rate, TGF. TGF=a2b2-a1b1/a1b1×100%)。观察病灶内部和周边血管分布特征，用脉冲频谱多普勒检测血流动力学参数\[1\]。观察肾门及腹主动脉旁淋巴结变化，是否出现癌栓及液化坏死等。
1.5 病理检查 分别于植瘤后第7、9、11、13、15、17、19、21、23、25d行B超检查，1h后每组各处死1只兔。取肾癌组织戊二醛固定后行透射电镜观察，同时切取原发瘤灶及可疑淋巴结、肝脏、肺脏转移组织进行光学显微镜检查。剩余兔均于第30 天处死。
1.6 统计学处理 各变量保留两位有效数字，以±s表示。统计分析采用t检验和χ2检验。
2 结果
2.1 成瘤率 A、B、C三组实验兔成瘤率分别为40%、60%、100%。采用χ2检验，C组与A、B组比较有显著性差异(P<0.05)，A、B组之间差异不显著(P>0.05)，即瘤块包埋法较前两种方法有效。大体标本见兔VX2肾癌为突出于肾脏表面的结节样包块，与周围分界清楚，有完整包膜形成，质地较硬，切面呈鱼肉样(图1)，晚期肾癌标本可见瘤体中央因缺血坏死而成豆渣样，病理显示鳞癌(图2)。
图1 兔肾VX2癌大体标本 (略)
Fig.1 General specimen of rabbit renal VX2 carcinoma model
图2 兔肾VX2癌肿瘤细胞(略)
Fig.2 Cells of rabbit renal VX2 carcinoma model (HE×400)
2.2 肿瘤生长特征变化 三组实验兔不同时间肿瘤体积及其环比增长速度见表1。瘤块包埋组(C组)全部成瘤并且生长稳定，肿瘤形态规则，在植瘤后11-21d，各监测时间体积增长无显著性差异(P>0.05)。病检发现当肿瘤体积增至15-20cm3时，肿瘤中央出现液化坏死，周围局部浸润及肝、肺、肾门淋巴结广泛转移。所以实验干预适宜于植瘤后2-3周内进行。
2.3 超声检测肿瘤的体积变化 各组实验兔均于B超检查后即刻处死1只，并实际测量肿瘤大小后计算体积。B超测量体积与肿瘤实测体积(表2)经配对t检验无显著性差异(P>0.05)。表明B超可以方便、快速、无创、准确的应用于肿瘤动态监测，筛检合格的实验动物
2.4 瘤体内部及癌周CDFI血流信号的检测 不同体积兔肾VX2癌瘤体内血流动力学变化见表3。 根据CDFI将瘤体及其周边血流分为星点状、短条状、树枝状、环状四种\[2\]。兔肾VX2癌为富血供肿瘤，癌灶周边呈高速低阻型，并有丰富环状血流信号包绕(82%)(图3)，可见血管分支深入瘤体内部。瘤体内部血流呈低速高阻型，血管分布以星点状、短线状居多(76%)(图4)。随肿瘤体积增大，瘤体内血管的搏动指数(PI)、阻力指数(RI)、S/D以及最大血流速度均呈增高趋势，最小血流速度呈下降趋势，但各组间均无显著性差异(P>0.05)。
表1 三组实验兔不同时间肿瘤体积及其增长率(略)
Table 1 The tumors size and its increasing rate of rabbit renal VX2 carcinoma model
表2 C组实验兔植瘤后不同时间B超监测与解剖实测肿瘤体积(cm3)的比较(略)
Table 2 Compared the tumor size(cm3) of rabbit renal VX2 carcinoma model by ultrasound and anatomy
表3 不同体积兔肾VX2癌瘤体内血流动力学的变化(略)
Table 3 The diversification of blood stream of rabbit renal VX2 carcinoma model with different size
图3 兔肾VX2癌瘤体周边血管分布呈环绕状 (略)
Fig.3 The vascularity around tumor of rabbit renal VX2 carcinoma
图4 兔肾VX2癌瘤体中央血管分布呈短线状(略)
Fig.4 The center vascularity in tumor of rabbit renal VX2 carcinoma
3 讨论
肾癌发病率居泌尿系肿瘤的第二位，且有逐年增高的趋势。在对肾癌的实验研究中，肿瘤模型通常选用裸鼠移植瘤，但其发生部位和生物学行为与人类肾癌不尽一致，因此迫切需要建立一种原位大型肾癌动物模型。VX2肿瘤细胞株起源于Shope病毒诱发的兔乳头状瘤衍生鳞癌，经过72次传代后正式建株，并可接种到兔肝脏、肾脏、肌肉、肺脏等部位，制成原位肿瘤动物模型。该肿瘤生长速度快，短期内即可发生广泛坏死，并形成肝、肺转移，故准确把握肿瘤成瘤性及其生长参数以选择最佳实验时机，在肾癌的发生与治疗学中尤为重要。
本实验采用三种不同方法建立兔VX2肾癌模型后比较其成瘤率，发现瘤细胞悬液注入组(A组)成瘤性最低，原因可能是悬液浓度偏低\[3\](107mol/L)，动物机体免疫力高低不同导致，而且本组操作程序复杂、费时、费力。瘤块液植入组(B组)成瘤性稍高，尽管经B超引导穿刺种植微创\[4\]，但模型成瘤后其瘤体形态极不规则，沿穿刺针道、腹腔、腹膜后广泛种植。瘤块包埋组(C组)采取切开植瘤，本组全部成瘤，经B超检测并手术切开验证肿瘤形态均匀规则。VX2瘤株种植成活后依次经过肿瘤血管形成期、肿瘤血管稳定期、肿瘤血管退化期\[5\]。本研究瘤块包埋组成瘤初期肿瘤均呈指数生长，2-3周体积增长稳定，是施加实验措施的最佳时期，3-4周肿瘤体积过大，中央血供不足易发生液化坏死及远处肝、肺、肾门淋巴结转移，4-5周血管退化导致肿瘤大片坏死，实验疗效的准确性较低。本组模型全部成瘤是因为瘤组织块提高了肿瘤细胞的种植浓度，增强了植瘤局部对机体免疫抵抗的屏障作用。植瘤手术应保持无菌、轻柔、熟练操作，瘤块修剪在冰块上进行，植入后明胶海绵压迫止血，生物蛋白胶堵塞针道以防止瘤块逆出或术野种植，手术集中在1.5h内完成，术后抗感染治疗。
B超监测兔VX2肾癌准确、简便、敏感度高，高分辨率B超可以发现直径3mm的小肿瘤\[6\]，并全面显示瘤体周边和中央的血流信号。对B超检出肿瘤均经病理证实，二维形态无差异性。本实验利用CDFI技术动态观察不同生长阶段兔肾VX2癌血管，可见早期血管环绕肿瘤周边呈抱球状，随后形成细小滋养血管深入到瘤体内部并逐渐丰富，最终因肿瘤血管退化而出现大片液化坏死区。同时确定了各阶段血流动力学参数值范围，为评价抗肿瘤血管药物疗效提供了无创性的早期参考指标。尽管兔肾VX2移植癌病理分型是鳞癌，与人类肾癌表现不完全一致，但因为造模方法简便易行，成瘤率高,肿瘤发生部位在肾脏,易于进行肾癌的实验研究, 仍不失为理想的大型实验动物模型。
参考文献：
\[1\]阎东明,杨波,宋来君,等. 右美沙芬对兔急性脑外伤后血流速度的影响 \[J\]. 郑州大学学报医学版, 2003, 38(6):939941.
\[2\]王文,段云友,吕发勤,等. 实验性兔肾VX2肿瘤的血流动力学变化研究 \[J\]. 中国医学影像技术, 2002,18(7):619621.
\[3\]Okada M, Kudo S, Saino T, et al. Antitumoral efficacy and pharmacokinetic properties of pirarubicin upon hepaticintraarter injection on the rabbit VX2 tumor model \[J\]. Br J Cancer, 1995, 71(4):518524.
\[4\]关利铭,胡凯,刘政,等. 超声引导穿刺接种建立兔肾癌模型 \[J\]. 中华实验外科杂志, 2000, 17(6):685.
\[5\]张洪新,刘燕,曹玮,等. B超引导瘤块移植法建立兔肾VX2移植癌模型 \[J\]. 肿瘤防治研究, 2004, 31(1):2729.
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(编辑 韩维栋)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(No. 30371831)
作者简介：王子明(1959)，男(汉族)，教授，硕士生导师. Email: ZimingW@263.net.
(西安交通大学医学院第二附属医院泌尿外科；西安交通大学医学院第一附属医院普外科；西安交通大学医学院第二附属医院超声科；西安交通大学医学院病理学教研室，陕西西安 710061；武功县医院，陕西武功 712200)
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