芦荟凝胶对大鼠Ⅱ度放射性皮炎创面愈合及表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子表达的影响
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摘要：目的 探讨芦荟凝胶对大鼠Ⅱ度放射性皮炎创面愈合及表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响。方法 建立大鼠Ⅱ度放射性皮炎模型，制备芦荟凝胶。实验动物分两组：自然愈合组(对照组)；芦荟凝胶组(实验组)。通过免疫组化染色及图像分析，测定伤后2、6、10、18、24d的创面愈合率及创面组织中EGF、bFGF的表达。结果 ①创面愈合率：芦荟凝胶组在10、18、24d各时相点的创面愈合率较自然愈合组高，差异有显著性(P<0.05)，尤以24d时相点差异最明显(P<0.01)。②EGF的表达：芦荟凝胶组总体的EGF表达量高于自然愈合组，差异有显著性(P<0.05)；芦荟凝胶组伤后10、18d时EGF表达高于自然愈合组，差异有显著性意义(P<0.05)。③bFGF的表达：芦荟凝胶组总体的bFGF表达量高于自然愈合组，差异有显著性(P<0.05)；芦荟凝胶组伤后18、24d时bFGF表达高于自然愈合组，差异有显著性意义(P<0.05)。结论 芦荟凝胶外涂对大鼠Ⅱ度放射性皮炎创面的愈合有促进作用，其机制可能与促进EGF、bFGF的表达有关。
关键词：芦荟；Ⅱ度放射性皮炎；表皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子
Effect of aloe gel on the wound healing rate and the expression of EGF and bFGF of radiative dermatitis erythematase in rats
Liu Xiaoping, Lu Jinli, Wu Suge, Yang Fang, Li Minzhong
(Department of Radiotherapy, First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University;Library, Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)
ABSTRACT: Objective To study the effect of aloe gel on the wound healing rate and the expression of epidermal growth factor (EGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) of radiative dermatitis erythematase in rats. Methods The rat models of radiative dermatitis erythematase (vesicular reaction) were established. With the normal healing group as the control group, aloe gel was used on the radiative dermatitis erythematase of rats in the experimental group. At the 2, 6, 10, 18 and 24d postinjury, the protein of EGF and bFGF were stained immunohistochemically and analysed; the wound healing rate was also measured. Results ① The wound healing rate: the wound healing rate of experiment groups was significantly higher than that of the control group at 10th day and 18th day (P<0.05). At the 24th day postinjury, there is significant difference between the two groups(P<0.01); ② Expression of EGF: the total expression of EGF in experiment groups was significantly higher than that of control groups (P<0.05), so was at 10th day and 18th day. ③ Expression of bFGF: the total expression of bFGF experiment groups was significantly higher than that of control groups. The significant difference was also found at 18th day and 24th day (P<0.05). Conclusion The aloe gel can promote the wounds of radiative dermatitis erythematase healing significantly. The expression of EGF and bFGF may be mechanism of accelerating the wounds healing.
KEY WORDS: aloe; dermatitis erythematase; EGF; bFGF
在肿瘤放射治疗中，放射性皮炎是最常见的不良反应之一\[1\]，影响着治疗的顺利完成，故防治放射性皮炎的药物备受关注。目前国内外对芦荟凝胶抗放射性皮炎的临床研究较多，结果是肯定的，但机理性基础研究较少。我们采用免疫组织化学方法和图像分析技术，检测表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)在大鼠Ⅱ度放射性皮炎组织中的表达，探讨芦荟凝胶防治放射性皮炎的机理。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂 兔抗人EGF单克隆抗体(武汉博士德生物制品公司)，兔抗人bFGF单克隆抗体(Santa Cruz Inc.)；加速器 CL1800(美国制造)，Q550CW 图像信号采集与分析系统(德国制造)。
1.2 芦荟凝胶的制作 美国芦荟1株，购于西安植物园。取新鲜芦荟叶200g，洗净，在粉碎机中粉碎成浆状，密封包存。每4d制作1次。
1.3 大鼠10%Ⅱ度放射性皮炎模型的建立 采用6Mev电子线，吸收计量率400cGy/min ，照射距离1m ，吸收剂量40Gy，一次照射，对大鼠裸露的背部产生10%Ⅱ度放射性皮炎。
1.4 实验动物及分组 清洁SpragueDawley大鼠55只，体质量(220±20)g ，均雄性，由西安交通大学医学院动物中心提供。照射后的大鼠随机分成两组：对照组(自然愈合组)25只，实验组(芦荟凝胶组)25只。实验组鲜芦荟凝胶外涂辐射伤口区，每日两次。对照组有感染情况时，用抗生素外涂。另取5只大鼠进行假照射，作为正常对照组。辐射伤后2、6、10、18、24d各活杀大鼠5只，正常对照组5只大鼠2d活杀。首先将创面描记在半透明纸上，再取辐射伤口区的中间组织1cm×1cm大小，20%(体积分数)甲醛固定，保存。
1.5 创面愈合程度表示 将创面描记在半透明纸上，再以此为模板，将质地均匀的硬纸片剪成图样大小，以硬纸片重量间接地表示创面面积大小。创面愈合率(%)=(开始照射面面积未愈合创面面积)/开始照射面面积。
1.6 免疫组化及图像分析 EGF、bFGF以细胞黄染为阳性。从每张免疫组化染色切片中随机选取5个视野，输入Q550CW 图像信号采集与分析系统测量阳性细胞的平均灰度值，以此反映伤口局部EGF、bFGF的表达量。阳性细胞的平均灰度值与EGF、bFGF的表达量成反比。
1.7 统计学处理 所有数据储存于计算机内，用SPSS10.0统计软件，对实验结果进行t检验，以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 创面愈合率比较 实验组在10、18、24d时相点创面愈合率高于对照组,两组间差异具有显著性(P<0.05)，且24d时相点差异最为显著(P<0.01，表1)。
2.2 EGF的表达 实验组EGF在2、6d时相点表达增高不明显，在10、18d时相点表达明显增高，两组间差异有显著意义(P<0.05)，24d时相点又接近对照组(表2)。实验组EGF的总体灰度值(128.81±13.27)低于对照组(131.71±9.46)，即EGF总体表达高于对照组，差异有显著意义(t=2.37,P<0.05)。
2.3 bFGF的表达 实验组bFGF表达稍迟于EGF，在2、6、10d时相点表达增高不明显，在18、24d时相点表达明显增高,两组间差异有显著意义(P<0.05，表3)。实验组bFGF的总体灰度值(123.82±10.58)低于对照组(140.31±8.29)，即bFGF的总体表达高于对照组，差异有显著意义(t=2.25，P<0.05)。
表1 创面愈合率的比较(略)
Table 1 The wound healing rate at different time
表2 创面各时相点EGF表达情况(灰度值)(略)
Table 2 The expression of EGF at different time
表3 创面各时相点bFGF表达情况(灰度值)(略)
Table 3 The expression of bFGF at different time
3 讨论
创伤愈合的组织修复过程是由炎细胞反应、修复细胞反应、细胞外基质反应和细胞因子(生长因子)作用等几个基本环节(要素)相互网络联动而实现的。关于电离辐射创伤愈合延缓的研究已有不少文献报道，所提出的基本原因可概括为：炎症反应削弱，细胞增殖受抑，生长因子表达减少，细胞外基质反应减弱，局部组织缺血缺氧，伤部并发感染、出血、水肿等。
芦荟的抗辐射作用受到学者的重视，同时芦荟的抗辐射作用也越来越被人们应用在日常生活及临床中,但其作用机理尚不清楚。
表皮生长因子(EGF)为有丝分裂刺激原，可以加快细胞分裂，促进增殖，还可以改变细胞的趋化性，增加细胞迁移。本实验结果显示，两组EGF蛋白阳性表达的细胞分布一致，主要为巨噬细胞、真皮成纤维细胞、毛囊上皮细胞及血管内皮细胞，这些部位是创面修复细胞的增殖活跃部位，与文献报道相一致\[2\]。芦荟凝胶组创面EGF的表达量于伤后10d达到高峰，早于对照组，而且EGF的表达总量明显高于对照组的表达总量，提示芦荟促进了EGF的合成和分泌。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在正常组织中表达很弱，在创伤愈合时明显增加。本实验中，对照组与实验组bFGF蛋白阳性表达的细胞同为巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞，与文献报道相一致\[3\]。实验组创面bFGF蛋白阳性表达在伤后18、24d明显高于对照组，且其表达总量亦明显高于对照组，提示芦荟对bFGF的合成和分泌有促进作用。同时，结果还显示，实验组创面愈合率的提高在时间上与EGF、bFGF表达增高相一致。
研究表明，在皮肤的辐射损伤中内源性EGF和 bFGF的合成细胞主要是巨噬细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等，并借助自分泌和旁分泌方式，参与损伤部位的细胞代谢和增殖，促进创面修复。而辐射引起这些细胞在数量和功能上的下降是内源性EGF和 bFGF减少的主要原因，能促使这三种细胞修复和增殖的方法均能提高辐射损伤中内源性EGF和 bFGF的合成和分泌\[46\]。芦荟多糖(ACM)能激活巨噬细胞，通过增强诱导型一氧化氮合酶(iNOs)mRNA的表达而增加NO的合成，刺激巨噬细胞分泌细胞因子(IL1、IL6、TNFα等)、释放NO，刺激巨噬细胞表面分子的表达以及引起细胞形态的改变，从而发挥其生物活性\[7\]。NO不但可以激活巨噬细胞，而且可以调节血管收缩功能，还具有促进内皮细胞的迁移、增殖并影响受损内皮细胞的修复等\[8\]。皮肤成纤维细胞受到大剂量照射后，细胞释放超氧阴离子自由基呈显著增高，其增高与照射剂量呈正相关；细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力明显下降，且与照射剂量呈负相关。这是辐射引起成纤维损伤和凋亡的基础\[9\]。研究发现经修饰过的MAP不仅可以活化巨噬细胞，而且可以刺激成纤维细胞的生长，预防紫外线辐射导致的免疫抑制\[10\]。
本实验结果提示芦荟凝胶可能通过改善巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞和表皮细胞的数量和功能，促进内源性EGF和 bFGF的合成和分泌，从而加速辐射创面的愈合。
参考文献：
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(编辑 卓选鹏)
基金项目：陕西省中医管理局基金项目(No. 2001018)
作者简介：刘小平(1962)，男(汉族)，硕士/主治医师，从事肿瘤放疗专业.
(西安交通大学医学院：第一附属医院肿瘤放疗科；图书馆，陕西西安 710061)
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