涎腺肿瘤中Ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白的表达及意义
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参见附件(422KB，4页)。
摘要：目的 探讨涎腺肿瘤中Survivin蛋白的表达情况，明确其表达与涎腺肿瘤的发生、发展及临床病理的关系。方法 制备组织芯片，应用pictureTM法进行免疫组化染色。结果 ① Survivin蛋白在涎腺良性肿瘤中的阳性表达率显著低于交界性肿瘤、恶性肿瘤及癌旁腺体中的表达(P均<0.005)；交界性肿瘤与恶性肿瘤中的表达无显著性差异(P>0.05)；而恶性肿瘤中的表达高于癌旁腺体中的表达，且差异有显著性(P<0.01)。②在恶性肿瘤中，低分化者的Survivin阳性表达率明显高于高分化者(P<0.0005)；有淋巴结转移者明显高于无淋巴结转移者(P<0.0005)；复发瘤明显高于原发瘤(P<0.05)；而不同性别、年龄及不同大小的肿瘤间均无显著性差异(P>0.05)。结论 Survivin蛋白表达与涎腺恶性肿瘤的发生、发展及预后有关，可作为涎腺恶性肿瘤早期诊断及预后判断的可靠指标。
关键词：涎腺肿瘤；Survivin；组织芯片；免疫组织化学
The study on expression of survivin protein in salivary gland tumor
Qi Hong, Wang Kangmin, Liang Yongqiang, Yang Lilin
(Department of Pathology of the Stomatologic Hospital, School of Medicine, Xian Jiaotong
University, Xian 710004;Department of Pathology, Second Hospital of Xian Jiaotong
University, Xian 710004;Hebei Coal Medical College, Tangshan 063000, China)
ABSTRACT: Objective To discuss the Survivin protein expression in different salivary gland tumor. Methods This experiment was based on tissue chip technology. Expression of Survivin protein in the salivary gland tumor was analyzed with immunohistochemical methods. Results ① Survivin expression showed significant difference in the salivary gland benign and malignant tumors (P<0.005), and relay tumors(P<0.005). The positive expressions were almost the same in relay and malignant tumors(P>0.05). The gland around the malignant tumor showed diversity compared with malignant tumor (P<0.01). ② The Survivin expression showed remarkable correlation with histological differentiation degree(P<0.0005), lymph node transfer(P<0.0005), and relapse(P<0.05), but it had nothing to do with the patient sex, age and the size of the tumor (P>0.05). Conclusion Survivin expression has correlation with the relay tumor canceration, and the gland around malignant tumor has correlation with occurrence, progress, prognosis in the salivary gland malignant tumor, and it is a reliable marker of earlier period diagnosis and prognosis of the malignant tumor of salivary gland.
KEY WORDS: salivary gland tumor; Survivin; tissue chip; immunohistochemistry
涎腺肿瘤是最常见的头颈部肿瘤，不仅威胁患者的生命和身心健康，而且影响美容。如何提高涎腺肿瘤的诊断和治疗水平，提高患者的生存率及生存质量是涎腺肿瘤研究中需要迫切解决的问题。Survivin作为一种新的凋亡蛋白抑制因子(IAP)，以其独特的结构、特殊的组织分布及明显的抗凋亡作用，使其在多数肿瘤发病机制中的作用日益为人们所重视，其作为肿瘤诊断标记物和基因治疗靶点的研究已初露端倪。
1 材料与方法
1.1 标本来源 选取西安交通大学医学院口腔医院1998年至2002年存档涎腺肿瘤标本118例。其中良性肿瘤27例：基底细胞腺瘤(BCA)7例，肌上皮瘤(ME)6例，多形性腺瘤(PA)14 例；交界性肿瘤10例：交界性肌上皮瘤1例，交界性多型性腺瘤9例；恶性肿瘤81例：癌在多形性腺瘤中(MPA)11例，黏液表皮样癌(MEC)12例，腺样囊性癌(ACC)25例，腺泡细胞癌(SCA)10例，腺癌(NOS)12例，乳头状囊腺癌(PCAC)5例，腺鳞癌(AEC)3例，导管癌(SDC)3例。其中高分化癌51例，中、低分化癌30例。癌旁腺组织60例。另取人胚胎8周腮腺1例，人正常颌下腺及腮腺各1例，狗正常颌下腺1例。40g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋。
1.2 主要试剂 鼠抗人Survivin单克隆抗体为美国Santa Crus公司产品；免疫组化PV6000试剂盒及DAB显色试剂盒为Zymed公司产品，均购自北京中山公司。
1.3 方法
1.3.1 组织芯片的制备 采用人工方法制备涎腺肿瘤组织芯片。蜡块切片经资深专家复核、诊断和分型，标记有关区域。设计点阵，制作受体腊块，打孔，采集组织芯，放在受体蜡块相应点阵孔上(孔深3mm，间距0.1cm)，同时记录样本位置。保证样本处于同一平面，冷却保存,制蜡块两块，5μm连续切片，40℃裱片，HE染色各1张评定芯片质量，其余裱于多聚赖氨酸胶片上，经56℃烤片3h后，37℃恒温箱中过夜，-20℃冰箱中待用。免疫组织化学染色采用PictureTM法染色(一步法)。PBS代替一抗做替代对照。
1.3.2 阳性结果判定 由两位病理医师在不知道任何临床和病理资料的情况下对免疫组化结果进行描述、评估。以出现棕黄色颗粒为阳性细胞。将阳性细胞按其数量及染色强度分为3级: 弱阳性表达(+)，即阳性细胞数小于10%，显色强度为淡黄色或仅个别细胞呈黄至棕黄色染色；强阳性表达()，即阳性细胞数为60%以上，多数细胞呈黄至棕黄色染色，染色强度为中至强阳性，少数细胞可为弱阳性表达；中度阳性()，即阳性细胞数及显色强度介于弱阳性与强阳性两级之间；阴性(-)，为染色强度与背景无明显差别。
1.4 统计学处理 构成比资料采用χ2检验，单向有序列联表资料采用秩和检验，以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 组织芯片的质量评定 2个组织芯片蜡块共切片60张HE切片。载玻片上组织阵列整齐，193个微组织块无脱失，有6块组织部分折叠或部分缺失，其余组织形态保存完好，完好率96.89%>85%，芯片质量肯定(图1)。
图1 涎腺肿瘤组织芯片(略)
Fig.1 Tissue chip of the salivary gland tumor
a: paraffin blok of tissue chip; b: HE; c: immunohistochemistry
2.2 Survivin 蛋白在涎腺不同组织中的表达分布特征 Survivin阳性染色主要定位于细胞质，部分可见胞核着色，为粗细不一的棕黄色颗粒，瘤细胞周围背景清晰，其表达情况如下：①在胚胎腮腺组织中，腺泡及导管中Survivin 蛋白均呈阳性表达(图2a)；正常人、狗涎腺组织中腺泡均未见Survivin蛋白表达，而纹管、闰管上皮见弱阳性表达(图2b)。②在良性肿瘤中，BCA、ME均无Survivin 蛋白表达；PA阳性表达1例,且该例阳性主要表达于鳞状化生区。③在交界性PA中，阳性主要表达于肿瘤性上皮细胞，包括导管结构内层的腺管上皮细胞和外层的肌上皮细胞，肌上皮团块及鳞状化生区域的细胞浆中亦有表达，而在黏液软骨样区几乎不表达(图2c)。④在恶性肿瘤中，MEC中Survivin在中间细胞、表皮样细胞均可见胞浆表达，而黏液细胞仅部分病例中可见表达(图2d、e)；MPA中恶性部分的阳性表达同其相同类型的恶性肿瘤的表达一致，良性部分同交界性PA的表达一致(图2f)；NOS中在肿瘤性上皮大部分呈阳性表达，多数定位于胞浆(图2g)；PCAC中肿瘤性腺上皮均示胞浆表达(图2h)；ACC中腺上皮表达强于肌上皮表达(图2i，j)；AEC中鳞癌成份表达强度及数量均大于腺癌成份(图2k)；SDC中几乎肿瘤细胞胞浆均有表达(图2m)；SCA均为细胞浆表达，较均匀且较弱(图2n)，而淋巴结内转移性腺癌阳性表达较强(图2o)。⑤在癌旁腺体中，除纹管、闰管阳性表达外，31.67%的癌旁腺体存在腺泡及大导管强弱不等阳性表达(图2p)。
图2 正常涎腺组织、涎腺肿瘤及癌旁腺体涎腺中Survivin蛋白的表达(略)
Fig.2 The expression of Survivin via immunohistochemistry method in the salivary gland, the salivary gland tumor, and the gland around the malignant tumor PictureTM×200
a:embryonic parotid gland; b: normal salivary gland; c: the gland around the malignant tumor; d,e: mucoepidemoid carcinoma; f: malignant pleomorphic adenoma; g: adenocarcinoma; h,i: adenoid cystic carcinoma ; j: adenoid cystic carcinoma ; k,l: adenoid cystic carcinoma; m: relay pleomorphic adenoma; n: papilary cystadenocarcinoma; o: ductal carcinoma; p: the metastasis of adenocarcinoma in lymph node
2.3 Survivin 蛋白在涎腺肿瘤中的表达
2.3.1 Survivin蛋白在涎腺良性、交界性、恶性肿瘤及癌旁腺体中的表达 Survivin蛋白在涎腺良性肿瘤中的阳性表达率显著低于在交界性肿瘤、恶性肿瘤及癌旁腺体中的表达(P均<0.005)；交界性肿瘤与恶性肿瘤中的表达无显著性差异(P>0.05)；而恶性肿瘤中的表达明显高于癌旁腺体中的表达，且差异有显著性(P<0.01，表1)。在免疫组化芯片中，1例组织芯(PA) 脱失，未计入统计结果。
表1 涎腺良性、交界性、恶性肿瘤及癌旁腺体中Survivin蛋白的表达(略)
Table 1 Expression of survivin protein in benign tumor, relay tumor, malignant tumor, and the gland around the malignant tumor of the salivary gland
2.3.2 涎腺恶性肿瘤中Survivin蛋白表达与临床病理的关系 在恶性肿瘤中，低分化者的Survivin阳性表达率明显高于高分化者(P<0.0005)；有淋巴结转移者明显高于无淋巴结转移者(P<0.0005)；复发瘤明显高于原发瘤(P<0.05)；而不同性别、年龄及不同大小的肿瘤间均无显著性差异(P>0.05，表2)。
3 讨论
目前研究已揭示，Survivin参与了细胞周期调控，与多数肿瘤的发生、发展和预后密切相关。Survivin在成熟组织中很少表达，仅在胚胎组织和发育过程中的组织中表达。当正常细胞恶变时Survivin表达，在转化系细胞和恶性肿瘤组织中呈高表达。目前有关Survivin在涎腺肿瘤中的表达研究国内外尚未见文献报道。本研究以组织芯片技术为依托，采用免疫组化PictureTM法检测涎腺肿瘤中Survivin蛋白的表达(PictureTM检测方法只使用抗体的抗原结合片段，可以完全避免内源性生物素和抗体FC段可能造成的背景染色，敏感而特异性强)，旨在将Survivin引入涎腺肿瘤的研究领域，探讨Survivin在涎腺肿瘤发生、发展中的作用。
本研究结果显示，在正常涎腺中，Survivin表达有一定的特殊性。我们所做的3例人正常腮腺、颌下腺组织及1例狗涎腺组织，腺泡中均未见Survivin蛋白表达，而纹管、闰管上皮均见弱阳性表达。这与以往大多数研究发现Survivin在人体组织中除了在胎盘、胸腺及结肠隐窝中微弱表达外，其他组织中均未检测到其表达\[13\]的结果有所不同。我们考虑纹管上皮可能与闰管上皮相同，可多向分化，具有干细胞潜能，因此推测涎腺肿瘤的发生可能与纹管、闰管有关。
表2 涎腺恶性肿瘤中Survivin蛋白表达与临床病理的关系(略)
Table 2 Expression of survivin protein in salivary gland malignant tumor
本研究结果还显示，涎腺良性肿瘤与交界性肿瘤、恶性肿瘤相比，Survivin的阳性表达率均有显著性差异(P<0.005)，提示Survivin基因的翻译表达与涎腺良性肿瘤的发生无关，而与涎腺恶性肿瘤的发生、发展有关。涎腺交界性肿瘤与恶性肿瘤中Survivin 蛋白阳性表达无显著性差异(P>0.05)，说明交界性肿瘤具有恶变潜能，Survivin基因在涎腺肿瘤恶性改变的早期就发挥着重要作用，有望成为涎腺肿瘤早期诊断的标志物。
Noriyuki等\[4\]对31例子宫内膜癌的研究结果表明，Ⅰ级Survivin阳性表达率为43.5%,Ⅱ级为49.3%，Ⅲ级为73.2%,Ⅳ级为88%，Ⅲ、Ⅳ级分别与Ⅰ、Ⅱ级比较存在显著差异，指出Survivin表达与子宫内膜癌的分化程度有关。同样，Lehner等\[5\]也证实了Survivin的表达与子宫癌的分化程度有关。本研究结果提示，在涎腺恶性肿瘤中，Survivin蛋白的表达与涎腺肿瘤的分化程度有关，即分化程度越高Survivin蛋白的阳性表达率越低，与上述研究结果一致。
Survivin蛋白表达与涎腺恶性肿瘤的淋巴结转移有关。在本研究中，16例有淋巴结转移者中，15例Survivin蛋白表达阳性，阳性率为93.75%，且阳性表达较强，提示Survivin基因上调可能促使涎腺肿瘤的转移。Sarela等\[6\]对144例结直肠癌的研究结果提示，Survivin表达预示着结直肠癌的复发及淋巴结转移，Survivin 阴性者5年生存率为 94.4%，而阳性者仅为44.8%，与本研究在涎腺肿瘤中得出的结论一致。Survivin蛋白表达与涎腺恶性肿瘤的复发有关。本研究中11例复发病例81.81% Survivin阳性表达，而非复发病例表达率为47.69%，二者存在显著性差异(P<0.05),与Takamizawa等\[7\]在肾肿瘤研究得出的Survivin阳性者中82%复发的研究结果一致。同时，本研究中Survivin蛋白表达与涎腺恶性肿瘤患者的性别、年龄、肿瘤的大小均无相关性(P>0.05)，支持了Monzo等\[8\]对83例非小细胞肺癌的研究结果。
综上所述， Survivin蛋白的表达与涎腺恶性肿瘤的发生、发展及预后有关，其表达程度越高，凋亡细胞越少，肿瘤恶性程度越高，转移可能性越大，其预后越差。Survivin被激活的机理，目前尚未见有文献报道，有待进一步研究。
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\[7\]Takamizawa S, Scott D, Wen J, et al. The survivin: fas ratio in pediatr renal tumors \[J\]. J Pediatric Surg, 2001,36(1):3742.
\[8\]Monzo M, Rosell R, Felip E, et al. A novel antiapoptosis gene: Reexpression of survivin messenger RNA as a prognosis marker in nonsmallcell lung cancers \[J\]. J Clin Oncol,1999, 17(7):21002104.
(编辑 卓选鹏)
基金项目：西安交通大学医学院口腔医院院青年基金
作者简介：齐红(1971)，女(汉族)，硕士，主治医师. 研究方向：涎腺肿瘤.
(西安交通大学医学院口腔医院病理科，陕西西安 710004；
西安交通大学医学院第二附属医院病理科，陕西西安 710004；
河北煤炭医学院，河北唐山 063000)
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