功能性矫治器引导大鼠下颌前伸后咀嚼肌基质金属蛋白酶ｍＲＮＡ的表达
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摘要：目的 研究功能性矫治器引导大鼠下颌前伸后咀嚼肌中基质金属蛋白酶(MMPs)mRNA的表达，探讨功能性颌骨矫形过程中咀嚼肌适应性变化的生物学机制，为矫形治疗提供新的理论依据。方法 分别采用RTPCR法、实时荧光定量PCR方法观察戴矫治器(实验组)和不戴矫治器(对照组)3、7、14、21d大鼠二腹肌前腹中MMP2、MMP9 mRNA表达和表达差异。结果 ①实验组和对照组大鼠二腹肌前腹中MMP2、MMP9 mRNA均有表达。②MMP2mRNA、 MMP9 mRNA表达差异：实验组3、21d后表达增加，其中21d较14、7d表达明显增加；而对照组21d较14、3d表达明显增加。结论 ①MMP2、MMP9在mRNA水平参与了咀嚼肌正常的生长发育过程；②功能性矫治器引导大鼠下颌前伸后咀嚼肌中MMPs在mRNA水平参与了咀嚼肌的适应性变化。
关键词：咀嚼肌；基质金属蛋白酶；mRNA；下颌前伸；RTPCR
Expression of matrix metalloproteinases mRNA in growing rats masticatory muscle after functional mandibular protrusion
Sun Huiling, Zhou Hong, Zou Min
(Research Center for Stomatology; Department of Orthodentics, Stomatology of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)
ABSTRACT: Objective To investigate molecular changes in growing rats masticatory muscle after functional mandibular protrusion. Methods SD rats were randomly divided into eight groups as control 3d, 7d,14d, 21d and experimental 3d,7d,14d,21d. The RTPCR and qPCR methods were used to find expression and any differences of mRNA of MMPs in growing rats masticatory muscle after functional mandibular protrusion. Results ① Expression of MMP2, MMP9 mRNA expressed in all growing rats masticatory muscle. ② Expression differences of MMP2 and MMP9 mRNA in 3d, 21d were found between control and experimental groups after functional mandibular protrusion. Conclusion ①MMP2 and MMP9 mRNA participate in masticatory muscle normal development. ② MMPs mRNA involve changes in growing rats masticatory muscle after functional mandibular protrusion.
KEY WORDS:masticatory muscle; MMPs; mRNA; mandibular protrusion; RTPCR
下颌骨的功能性矫形治疗是在生长发育期通过刺激患者的下颌骨生长达到矫治下颌骨发育不足畸形目的。在引导下颌前伸的过程中，除了骨组织在肌张力的作用下发生改建和生长外，咀嚼肌也会发生相应的变化和改建，以保持和稳定下颌骨生长的结果。近些年来，功能性矫治器的研究多集中在下颌骨的改建和生长上，特别是髁状突的适应性改建及其影响因素，而对咀嚼肌功能的适应性变化研究较少，对咀嚼肌适应性改变的生物学机制尚不清楚。
本研究通过检测功能性矫治器引导大鼠下颌前伸后咀嚼肌中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)mRNA的表达和表达差异，探讨功能性颌骨矫形过程中咀嚼肌适应性变化的生物学机制，为矫形治疗提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 选用健康的雄性SD大鼠40只，4周龄，体质量(70土5)g。随机分为8组：不戴矫治器的对照3、7、14、21d组，戴矫治器的实验3、7、14、 21d组，每组5只。自由饮水，定时摄食。
1.2 主要试剂 RNA提取试剂(Trizol)、反转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)：MBI Fermentas公司；PCRMasterMix：北京天为时代科技有限公司；DyNamo SYBR Green qPCR Kit(Finnezyme)：东盛创新生物公司赠。
1.3 矫治器的设计 参照Petrovic\[1\]使用的矫治器并加以改良。矫治器由塑料底板、斜面导板和口外固位臂三部分组成。斜面导板为6mm×8mm的带环片，斜面导板与上颌咬合平面成20°-25°，矫治器戴于大鼠上切牙。当大鼠闭口进行功能运动时，下切牙咬在斜面导板上，下颌被引导前伸。
1.4 标本制备 分别于戴矫治器3，7，14，21d后断颈处死。取实验组和对照组大鼠二腹肌前腹置于有RNALater液的DEPC处理的EP管中，迅速置于液氮罐中，于每次标本收集结束时移于-80℃冰箱保存。
1.5 二步法RTPCR 提取总RNA，逆转录合成cDNA第一链，分别按说明书进行。引物设计合成：MMP2上游引物：5’CTA TTC TGT CAG CAC TTT GG3′，下游引物：5′CAG ACT TTG GTT CTC CAA CTT3′，产物长度310bp；MMP9上游引物：5′TTG GCT TCC TCC GTG ATT3′，下游引物：5′TGT ATG GTC GTG GCT CAT A3′，产物长度293bp；β actin上游引物：5′TCC TTC CTG GGT ATG GAA TC3′，下游引物：5′ACT CAT CGT ACT CCT GCT TG3′，产物长度300bp。PCR DNA扩增按说明书进行。MMP2扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环，最后72℃再延伸7min。MMP9扩增反应条件为：MMP9的退火温度为60℃，其余条件同MMP2。
1.6 实时荧光定量PCR 提取总RNA，逆转录合成cDNA第一链同上。在进行DNA扩增时按DyNamo SYBR Green qPCR Kit说明书进行。MMP9，MMP2反应条件除反应为40个循环外，其余同PCR DNA扩增。
2 结果
2.1 MMP2、MMP9 mRNA的表达 RTPCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增片断特异性强，MMP2条带大小约310bp(图1)，MMP9条带大小约293bp(图2)，βactin条带大小约300bp(图3)，均与预期大小相符。MMP2，MMP9 mRNA在各实验组和对照组均有表达。
图1 MMP2 RTPCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果(略)
Fig.1 MMP2 agarose gel electrophoresis results of RTPCR production
1,2,3,4,5,6,7,8, represent 21dT, 21dC, 7dC, 7dT, 14dC, 14dT, 3dC, 3dT, respectively. T: test group; C: control group
图2 MMP9 RTPCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果(略)
Fig.2 MMP9 agarose gel electrophoresis results of RTPCR production
1,2,3,4,5,6,7,8, represent 21dT, 21dC, 7dC,7dT,14dC,14dT,3dC, 3dT, respectively. M: marker
图3 βactin RTPCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果(略)
Fig.3 βactin agarose gel electrophoresis results of RTPCR production
1,2,3,4,5,6,7,8, represent 21dT, 21dC, 7dC, 7dT,14dC,14dT, 3dC, 3dT, respectively
2.2 MMP2、MMP9 mRNA的表达差异
2.2.1 MMP2 mRNA在实验组和对照组的表达差异 见表1。
MMP2 mRNA 21d实验组的表达是对照组的2.8849倍，3d实验组的表达是对照组的31.6435倍，而7d、14d实验组的表达与对照组的表达虽然在量上有所减少，但倍数关系不具有统计学意义。MMP2 mRNA 3d、21d组实验组与对照组比较表达均增加。MMP2 mRNA实验组各时间点比较：实验组21d是14d的3.65倍、7d的3.43倍；对照组各时间点比较：对照组21d是3d的14.29倍，14d是3d的21.57倍，7d是3d的21.14倍。表明mRNA水平实验组21d比14d、7d增加；对照组21d比3d、14d比3d增加。
表1 MMP2mRNA的表达差异(略)
Table 1 Difference expression of MMP2mRNA
2.2.2 MMP9mRNA在实验组和对照组的表达差异 见表2。
MMP9 mRNA 21d实验组的表达是对照组的2.999倍，3d实验组是对照组9.009倍，而7d、14d实验组的表达与对照组虽然在量上有所减少，但倍数关系不具有统计学意义。MMP9 mRNA实验组21d是14d的2.24倍、7d的3.84倍；对照组21d是3d的5.46倍，14d是3d的12.27倍，7d是3d的6.37倍。表明mRNA水平实验组21d比14d、7d增加；对照组21d比3d、14d比3d增加。
表2 MMP9 mRNA表达差异(略)
Table 2 Difference expression of MMP9 mRNA
3 讨论
本研究RTPCR产物凝胶电泳结果显示正常生长期大鼠二腹肌前腹MMP2和 MMP9的mRNA均表达，这与Schoser等\[1\]发现人的正常骨胳肌中存在MMP2, MMP7，MMP9一致。Singh等\[2\]用免疫组织化学的方法显示正常人咀嚼肌中MMP9染色较弱，RTPCR法MMP2 mRNA可测到但MMP2不表达。Balcerzak等\[3\]发现牛骨胳肌中存在多种MMPs，MMP1、MMP 2、MMP 9、MMP 14、MMP 16及TIMP1、TIMP2、TIMP3。Kherif等\[4\]研究发现在成年小鼠MMP2和 MMP9的酶原和活性形式均表达。Kherif等\[5\]发现正常小鼠肌肉组织中MMP9见于神经肌肉接头处、雪旺氏细胞、肌内神经的神经束膜。免疫标记显示MMP2见于神经肌肉接头处但神经处降低，表明的正常骨胳肌中测到的MMPs mRNA的结果与上述文献报道相似；且在mRNA不同的观察时间里MMP2和MMP9的mRNA表达量处于动态变化中。由此可推论MMP2和MMP9存在于不同种属正常骨胳肌中，不同生长发育时间表达不同。说明MMPs在mRNA水平参与了正常骨胳肌生长发育过程中细胞外基质的重塑改建。
本研究实时荧光定量PCR结果显示，大鼠二腹肌前腹中3、21d实验组MMP2和MMP9的mRNA明显高于对照组，而7、14d MMP2和MMP9的mRNA表达稍降低，但不具有统计学意义。说明大鼠在下颌功能性前伸后 MMP2、MMP9mRNA水平发生变化，这与Hargreaves等\[6\]报道骨胳肌具有对各种生理刺激，包括对运动反应具有显著适应性的结果一致。运动引起骨胳肌中多种基因mRNA水平升高，这是由于转录激活和(或)mRNA稳定性升高。细胞对运动训练的适应性似乎是单次运动后基因转录水平瞬时升高的累积效应。与运动相关，潜在的刺激包括肌肉的伸张和肌张力，运动神经的活动类型，肌肉初期钙变化，细胞的能量负荷和作用底物的存在，氧张力和循环激素。这些是通过不同的细胞信号机制，作用于广泛的下游目标和广泛的转录因子。基因表达，虽然代表调控的特异位点，但仅仅是从刺激的开始到表现型的适应以及最终的生理反应的复杂过程的一步。 Koskinen等\[7\] 在大鼠跑步造成肌肉损伤的模型观察到，肱四头肌MMP2、TIMP2在mRNA水平与蛋白水平均升高。
Ahtikoski等\[8\] 在大鼠制动模型增长和减少的位置观察到比目鱼肌、腓肠肌IV型胶原mRNA水平降低，表明胶原蛋白的合成下调。MMP2酶原mRNA水平和活性在比目鱼肌、腓肠肌和趾长伸肌升高。BarShai等\[9\]观察大鼠骨胳肌制动后，幼年(6月龄)动物制动屈肌中MMP2和MMP9的活性明显增加。Lo 等\[10\]用RTPCR方法研究发现肩部回旋肌撕裂肌肉中MMP3 mRNA水平明显升高，TIMP2、TIMP3、TIMP4 mRNA水平降低。上述文献说明运动及各种不同外界因素可引起骨骼肌肌肉MMPs mRNA水平发生变化，表明下颌前伸引起了咀嚼肌中MMPs mRNA变化，MMPs mRNA参与了下颌前伸肌肉的适应性变化过程。
另外，本实验结果显示MMP2和MMP9 mRNA在7d、14d差异无意义，这可能是组织处于适应阶段。MMP2和MMP9 mRNA实验组21d比14d、7d表达增强，且有统计学意义。说明大鼠在戴矫治器后21d时MMP2和MMP9 mRNA明显参与了下颌前伸运动。MMP2和MMP9 mRNA在对照组3d、7d、14d随时间变化表达逐渐增加，而在21d时(相对于14d)增加不明显，说明MMP2和MMP9 mRNA在生长期大鼠咀嚼肌正常发育过程中有其生理规律。
参考文献：
\[1\]Schoser BG, Blottner D. Matrix metalloproteinases MMP2, MMP7 and MMP9 in denervated human muscle \[J\]. Neuroreport, 1999,10(13):27952797.
\[2\]Singh A, NelsonMoon ZL, Thomas GJ, et al. Identification of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors type 1 and 2 in human masseter muscle \[J\]. Arch Oral Biol, 2000, 45(6):431440.
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\[4\]Kherif S, Lafuma C, Dehaupas M, et al. Expression of matrix metalloproteinases 2 and 9 in regenerating skeletal muscle: a study in experimentally injured and mdx muscles \[J\]. Dev Biol, 1999, 205(1):158170.
\[5\]Kherif S, Dehaupas M, Lafuma C, et al. Matrix metalloproteinases MMP2 and MMP9 in denervated muscle and injured nerve \[J\]. Neuropathol Appl Neurobiol, 1998,24(4):309319.
\[6\]Hargreaves M, CameronSmith D. Exercise, diet, and skeletal muscle gene expression \[J\]. Med Sci Sports Exerc, 2002,34(9):15051508.
\[7\]Koskinen SO, Kjaer M, Mohr T, et al. Type IV collagen and its degradation in paralyzed human muscle: effect of functional electrical stimulation \[J\]. Muscle Nerve, 2000,23(4):580589.
\[8\]Ahtikoski AM, Koskinen SO, Virtanen P, et al. Synthesis and degradation of type IV collagen in rat skeletal muscle during immobilization in shortened and lengthened positions \[J\]. Acta Physiol Scand, 2003,177(4):473481.
\[9\]BarShai M, Carmeli E, Coleman R, et al. The effect of hindlimb immobilization on acid phosphatase, metalloproteinases and nuclear factorkappaB in muscles of young and old rats \[J\]. Mech Ageing Dev, 2005,126(2):289297.
\[10\]Lo IK, Marchuk LL, Hollinshead R, et al. Matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase mRNA levels are specifically altered in torn rotator cuff tendons \[J\]. Am J Sports Med, 2004,32(5):12231229.
(编辑 邱 芬)
基金项目：院青年基金资助项目
通讯作者：周洪. Email:zhou57@pub.xaonline.com.
作者简介：孙慧玲(1965)，女(汉)，主治医师，硕士. 研究方向：颅面颌生长发育形态与功能的关系. Email:Sunhling910@sohu.com
(西安交通大学口腔医院：口腔医学研究中心；正畸科， 陕西西安 710004)
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