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编号:11039237
体外诱导人脐血CD34+细胞向肝细胞的分化
http://www.100md.com 2006年4月1日 张芳婷 叶 静 万汇涓 龙 霞 聂李平 于 洁 房家智
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    参见附件(320KB，4页)。

     作者简介：张芳婷(1969 )，女(汉族)，硕士研究生，副主任技师，主要从事干细胞应用研究

    摘要：目的 探讨在体外培养条件下人脐血CD34+细胞向肝细胞的分化。方法 用磁性细胞分选试剂盒(MACS)分离出CD34+细胞后在含50mL/L FBS，1×ITS，4.7mg/L亚油酸，10-4mol/L 2磷酸抗坏血酸的低糖型DMEM中培养，并以FGF4(100μg/L)、HGF(20μg/L)进行诱导。分别于生长因子刺激前和刺激8、16d时留取细胞。通过RTPCR对ALB、AFP、GATA4等mRNA的表达水平进行检测；用免疫细胞化学染色检测ALB蛋白的表达，并收集培养液测定ALB的质量浓度。结果 流式细胞仪检测结果显示CD34+细胞的平均分离纯度>90%，达到分离要求。RTPCR检测到诱导后的CD34+细胞表达ALB、AFP、GATA4 mRNA。免疫细胞化学染色可见诱导16d的CD34+细胞出现ALB阳性表达细胞，ELISA检测表明诱导组8、16d培养液中的ALB质量浓度明显增高，与诱导前和未诱导组相比均有显著差异(P<0.01)。结论 在体外培养条件下，脐血CD34+造血干细胞可分化为表达白蛋白的类肝细胞。

    关键词：脐血CD34+细胞；肝细胞；分化

    Differentiation of human umbilical cord blood CD34+ cells into hepatocyte in vitroZhang Fangting, Ye Jing, Wan Huijuan, Long Xia, Nie Liping, Yu Jie, Fang Jiazhi

    (Central Laboratory of Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, China)

    ABSTRACT: Objective To investigate the differentiation of CD34+ cells derived from human umbilical cord blood into hepatocyte cells in an in vitro system supplemented with growth factors(GF). Methods CD34+ cells were isolated by magnetic cell sorting (MACS). The purity of acquired cells was determined by FACS analysis. Purified CD34+ cells were cultured in DMEM supplemented with 50mL/L FBS, 1×ITS, 10-4mol/L ascorbic acid 2phosphate, 4.7mg/L linoleic acid , and a combination of FGF4(100μg/L) and HGF(20μg/L). Cultured cells were collected after 8d and 16d to determine the extent of the cell conversion by microscopic observation on the morphology, RTPCR on the transcription of ALB, AFP and GATA4 mRNA, immunocytochemistry on the expression of ALB and ELISA on the quantification of the ALB product in the medium. Results CD34+ cells accounted for more than 90% after MACS. ALB, AFP and GATA4 mRNA and albumin protein positive cells were found in cultured cells after 16d. The ALB product in culture medium was significantly increased after culturing with GF in comparison with control groups (P<0.01). Conclusion A conversion of CD34+ cells derived from human umbilical cord blood into hepatocyelike cells had been observed in this experimental culture system.

    KEY WORDS: cord blood CD34+ cell; hepatocytes; differentiation

    骨髓、脐血中的干细胞能够分化为类肝细胞已经被众多实验研究所证实。随着研究的增多，人们已不满足于全骨髓或全脐血细胞的研究，而侧重于将这种能分化的细胞定位于某一亚群或某一类干细胞，旨在从根本上探讨这一分化的机制。目前已证实基质干细胞的众多亚群可分化为肝细胞，而造血干细胞的此类研究则相对较少。CD34+抗原是一种分子质量为110-120ku的高度糖基化的I型膜蛋白，主要存在于幼稚的造血干细胞和造血祖细胞质膜上以及少量内皮细胞表面。本实验拟采用体外培养的方法，探讨脐血CD34+造血干细胞转化为肝细胞的可能性。

     1 材料与方法

    1.1 材料 抗人CD34免疫磁珠(德国Miltenyi公司)、CD34PE(美国库尔特公司)、淋巴细胞分离液(上海华精生物公司)、低糖型DMEM、FBS(GIBCO公司)、胰蛋白酶(AMRESCO公司)、HGF、FGF4(RD公司)、1×ITS、亚油酸、2磷酸抗坏血酸、青链霉素、台盼蓝(Sigma公司)。RNA提取试剂为MRCGENE公司的TRIZOL REAGENT；一步法RTPCR试剂盒为FINNZYMES产品，50bp marker为GENERULAR公司产品；人白蛋白(ALB)、人甲胎蛋白(AFP)、GATA4引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，ALB上游引物5′CTTTCAAAGCATGGGCAGTAG3′，下游引物5′GCAGCAGCACGACAGAGTAA3′；GATA4上游引物：ACCTGGGACTTGGAGGATAG，下游引物：GACAAGGACATCTTGGGAAA；AFP上游引物5′ TGAGCACTGTTGCAGAGGAG 3′，下游引物5′ CTGAGACAGCAAGCTGAGGA3′。抗体：抗人ALB单克隆抗体(RD公司)、广谱二抗试剂盒(ZYMED公司)、白蛋白ELISA检测试剂盒(ALPHA DIAGNOSTIC san Antonio U.S.A.)。

    1.2 方法

    1.2.1 CD34+细胞的制备与鉴定 健康足月孕妇，待胎儿娩出后自脐静脉无菌采血。先用淋巴细胞分离液初步分离单个核细胞，再用磁性细胞分选试剂盒分离出CD34+细胞。具体步骤为：①用密度梯度离心法分离出脐血MNCs后，用300μL PBS+5g/L BSA重悬；②依次加入100μL FcR受体阻断剂和抗CD34免疫磁珠，混匀后4℃孵育30min；③细胞洗涤后过滤网去除滤块，然后将细胞过MS+柱，并用柱塞打出柱上吸附的CD34+细胞。收集分选后的CD34+细胞，PBS洗后，以100μL PBS重悬，加入10μL CD34PE 4℃孵育10min后，流式细胞仪检测。

    1.2.2 体外诱导 分离好的细胞以4×105/mL的密度接种于铺有鼠尾胶原的24孔板上，培养液为低糖型DMEM，含5%(体积分数)FBS，1×ITS，青霉素100U/mL，链霉素100μg/L，4.7μg/L亚油酸，10-4mol/L 2磷酸抗坏血酸，每孔加0.5mL，置于37℃、5% CO2、95%湿度的培养箱中培养。于培养第2天加入FGF4、HGF，质量浓度分别为100μg/L、20μg/L，并设不加因子组作对照。每周换液2次，加入生长因子。

    1.2.3 总RNA提取与RTPCR 收集诱导8、16d的细胞，按TRIZOL试剂说明书提取总RNA，获得的RNA采用紫外分光光度法检测定量。RTPCR反应总体积50μL，其中RNA为1μg，10×PCR buffer 5μL，10mmol/L dNTPs 1μL，50mmol/L MgCl2 1.5μL，5pmol/μL上下游引物各2μL，逆转录酶5U，Taq酶2U。一步法RTPCR反应条件：首先48℃ 45min进行逆转录；然后94℃ 2min预变性；94℃ 30s(变性)，58℃ 30s(退火)，72℃ 30s(延伸)，35个循环；最后72℃ 7min进行延伸。产物长度分别为ALB 411bp，GATA4 250bp，AFP 308bp，用12g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

    1.2.4 ALB免疫细胞化学染色 于诱导第16天低速离心收集细胞，PBS洗2次，用500μL PBS重悬，制备细胞滴片。用40g/L多聚甲醛和1.5g/L苦味酸固定10min后，PBS冲洗；依次加入过氧化物酶阻断剂、非免疫血清反应10min，甩弃多余液体；加一抗室温孵育30min，PBS洗3次；加生物素标记二抗10min；过氧化物酶标记的链亲和素10min，冲洗；DAB显色，乙醇脱水，二甲苯透明，封片。镜下选取数个高倍视野进行细胞计数。

    1.2.5 培养液中ALB质量浓度的测定 于诱导第8、16天用PBS冲洗培养的细胞后，换成无血清DMEM培养基，并加入0.15mol/L的NH4Cl，常规培养8h后收集细胞培养上清，用ELISA试剂盒检测培养上清中的ALB质量浓度。同时记录培养细胞数。检测灵敏度为1mg/L。

    1.2.6 统计学处理 计量资料均以±s表示并进行均数t检验，以P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著性。

     2 结 果

    2.1 诱导前FACS检测CD34+细胞纯度 采用Ficoll法分离脐血MNC，约可得到6×107-8×107/mL单个核细胞，在此基础上用MACS法分选脐血CD34+细胞，获得的细胞量为3×105-9×105/mL，经流式细胞仪检测有91%的分选细胞表达CD34+，表明分选纯度较高(图1)。

    图1 FACS检测结果(略)

    2.2 ALB、GATA4和AFP mRNA的表达 RTPCR结果表明，诱导前的CD34+细胞不表达ALB、GATA4、AFP mRNA。诱导后随着培养时间的延长，ALB、GATA4 mRNA表达量增加，呈上升趋势；培养至第8天的CD34+细胞AFP mRNA表达量最高，至第16天表达量明显下降(图2)。图2 ALB、GATA4 、AFP mRNA RTPCR产物电泳图(略)

    2.3 ALB蛋白表达 免疫细胞化学染色结果显示，CD34+细胞在诱导前ALB染色呈阴性反应，诱导后16d取出细胞，染色发现有阳性细胞出现，阳性细胞胞质紫红色，苏木素复染后细胞核蓝色(图3)。细胞阳性率达35%。图3 ALB免疫细胞化学染色结果(略)

    2.4 培养液上清中白蛋白的质量浓度 ELISA检测结果发现，CD34+细胞单独培养组即未诱导组培养0、8、16d的ALB值无显著性差异，诱导组培养0、8、16d的ALB值差异明显，而且ALB的表达随着培养时间延长有逐渐升高的趋势。与同期单独培养组相比，除培养0d时无差异外，其余两个时间段的ALB产量均有显著差异(P<0.01，图4)。图4 ELISA检测结果(略)

    3 讨 论

    成体干细胞的可塑性现象已被多个实验室报道。这一发现启发我们利用简便易得、来源丰富的某类干细胞通过体外诱导分化或直接移植的方法能够治疗诸如急性肝损伤的疾病。脐血采集方便、富含造血干/祖细胞，与骨髓中的干细胞相比，脐血干细胞更幼稚、免疫原性更弱，是继骨髓和外周血后的第三种造血干细胞来源。在我们的前期工作中，已通过与小鼠受损肝组织共培养方式、体外加生长因子诱导培养方式和肝损伤裸鼠体内移植方式探讨了脐血单个核细胞向肝细胞分化这一问题，初步证实了可塑性的存在。本次研究着重探讨脐血CD34+造血干细胞向肝细胞分化的可能性。目前，利用人骨髓CD34+造血干细胞分化为表达白蛋白的类肝细胞已得到体内动物实验的证实。方法为首先建立一个免疫缺陷鼠的急性肝损伤模型，然后将分离纯化的CD34+细胞通过尾静脉或门静脉输入急性损伤鼠体内，一段时间后通过FISH、免疫组化、分子生物学指标鉴定受体肝脏中的供体细胞的分化表达。这些研究进一步发现：压力诱导信号如SDF1、MMP9 和HGF的表达增加能够促使人CD34+细胞归巢于免疫缺陷鼠的肝脏。而Kollet和Kakinuma的研究证实：FGF、LIF、SCF、HGF、OSM等生长因子在肝前体细胞的增殖和分化中起着不同的作用，尤其是HGF、FGF4可以直接诱导分化的发生。据此本试验采用HGF、FGF4这两种因子促进脐血CD34+细胞的分化。AFP、ALB分别是幼稚、成熟肝细胞的特异性标志物。GATA4是肝脏分化过程中的转录因子之一，能够与ALB增强子结合并上调ALB表达。经MACS法分离出CD34+细胞后，在培养液中添加HGF和FGF4，当培养至第8天时，观察有少量体积增大、细胞核大而圆、胞浆丰富的细胞出现。培养第16天时此种细胞增多。分别于这两个时间点收集细胞，做RTPCR检测，发现随着培养时间的延长，ALB和GATA4 mRNA表达量逐渐增加，AFP mRNA表达量在培养第8天时最高，第16天下降。这与肝细胞的发生规律相符合。免疫组化和ELISA检测进一步证实了这一结果。 当然，仅仅根据上述结果就简单的得到脐血CD34+细胞具有向肝细胞分化的可塑性这一结论尚为之太早。确切地作出结论需要更加严谨的体外对比试验和动物体内实验来验证由这一分化方式得来的细胞的功能性。我们拟在此基础上进一步探讨脐血CD34+细胞的可塑性，并将体外培养环境下得到的白蛋白阳性细胞微囊化处理后直接移植到肝损伤模型中，以检测这一分化细胞的功能性。

    采用体外培养的方法诱导人脐血CD34+细胞向肝细胞的分化，初步探索了脐血造血干细胞向肝细胞定向分化的机制。随着对干细胞可塑性研究的不断深入，有望今后在临床治疗急、慢性肝功能衰竭和肝脏代谢性疾病中发挥作用。

     参考文献：

    [1]Petersen BE, Bowen WC, Patrene KD, et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells . Science, 1999, 284(5417):11681170

    [2]Schwartz RE, Reyes M, Koodie L, et al. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocytelike cells . J Clin Invest, 2002,109:12911302.

    [3]Jang YY, Collector MI, Baylin SB, et al. Hematopoietic stem cells convert into liver cells within days without fusion . Nat Cell Biol, 2004, 6:532539.

    [4]张芳婷，于洁，叶静,等. 人脐血干细胞分化为肝细胞的研究. 现代肿瘤医学, 2005,13(2):177179.

    [5]于洁，张芳婷，万汇涓,等. 体外模拟肝损伤环境下人脐血细胞向类肝细胞的分化 . 北京大学学报(医学版), 2005,37(4):402405.

    [6]Wang X, Ge S, McNamara G, et al. Albuminexpressing hepatocytelike cells develop in the livers of immunedeficient mice that received transplant of highly purified human hematopoietic stem cells . Blood, 2003, 101(10):42014208

    [7]Newsome PN, Johannessen I, Boyle S, et al. Human cord bloodderived cells can differentiate into hepatocytes in the mouse liver with no evidence of cellular fusion . Gastroenterology, 2003,124(7):1891900.

    [8]Ishikawa F, Drake CJ, Yang S, et al. Transplanted human cord blood cells give rise to hepatocytes in engrafted mice . Ann N Y Acad Sci, 2003,996:174185.

    [9]Danet GH, Luongo HL, Butler G, et al. C1qRp defines a new human stem cell population with hematopoietic and hepatic potential . Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(16):1044110445.

    [10]Kollet O, Shivtiel S, Chen YQ, et al. HGF, SDF1, and MMP9 are involved in stressinduced human CD34+ stem cell recruitment to the liver . J Clin Invest, 2003,112(2):160169.

    [11]Kakinuma S, Tanaka Y, Chinzei R, et al. Human umbilical cord blood as a source of transplantable hepatic progenitor cells . Stem Cell, 2003,21(2): 217

    227.

    [12]唐力军，高毅，张志,等. HGF+FGF4体外定向诱导人骨髓来源的多能成体祖细胞向肝样细胞分化的特征性表型鉴定 . 解放军医学杂志, 2004,29(11):973976.

    (北京大学深圳医院中心实验室，深圳 518036)

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