人尿道狭窄瘢痕组织中胶原蛋白含量和转化生长因子β1的表达及意义
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作者简介：程伟(1963)，男(汉族)，博士，副教授. 研究方向：泌尿生殖系肿瘤、男科学.
摘要：目的 探讨人尿道瘢痕组织中胶原蛋白含量和转化生长因子β1(TGFβ1)的表达及其意义。方法 应用免疫组织化学SP法和VG染色方法检测了16例尿道狭窄患者及6例正常人尿道组织中的TGFβ1表达和胶原蛋白含量。结果 尿道狭窄瘢痕组织中TGFβ1蛋白表达较强，阳性表达率100%，且其表达主要集中在瘢痕成纤维细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞的胞浆和胞膜；而正常尿道组织中TGFβ1表达较弱，阳性表达率仅为33.3%。两组比较差异有显著性(P<0.05)。VG染色结果显示尿道瘢痕组织中胶原纤维染色密集，成束状排列；而正常尿道组织胶原纤维染色淡，成网状排列。结论 TGFβ1和胶原蛋白与尿道瘢痕形成关系密切，抑制TGFβ1过度表达将有助于预防和减轻尿道狭窄的发生。
关键词：尿道瘢痕；转化生长因子β1；胶原蛋白；免疫组织化学
尿道狭窄是泌尿外科的常见病，其临床治疗是一大难题，目前仍未走出狭窄扩张/手术再狭窄的病理过程。为了探讨尿道狭窄的形成机制，我们采用免疫组织化学技术和VG染色方法检测了正常人尿道组织和尿道狭窄患者瘢痕组织中转化生长因子β1(transform growth factorβ1, TGFβ1)的表达和胶原蛋白含量，探讨其在尿道狭窄形成过程中的作用及意义。
1 材料与方法
1.1 一般资料 收集1994年-2004年我院收治的16例尿道狭窄患者的手术标本。患者均有外伤史，病程3个月-3年，其中4例为经尿道内切开术后再狭窄患者。6例正常尿道组织取自尸检标本。全部标本用10%(体积分数)甲醛溶液固定，石蜡包埋后5μm厚连续切片，分别作HE和VG染色。
1.2 免疫组织化学染色 第一抗体兔TGFβ1多抗为Santa Cruz公司产品，SP试剂盒为Zymed公司产品。采用SP法，严格按照试剂盒说明操作。主要染色步骤：切片常规脱蜡至水；H2O2 灭活内源性过氧化物酶；微波修复抗原；正常山羊血清封闭；滴加多克隆兔抗人TGFβ1抗体，4℃过夜；滴加生物素化二抗及SP复合液，37℃孵育10-30min；二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。用已知TGFβ1阳性切片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液(PBS)分别代替一抗、二抗及SP液作阴性对照。阳性细胞评定标准：以细胞膜和(或)细胞浆染成棕黄色为阳性细胞。细胞的着色强度可分为以下级数：(-)为阴性细胞；(+)为细胞膜和(或)细胞浆染成淡棕黄色；()为深棕黄色；而()则介于两者之间。应用VIDAS图像分析仪，对各组切片单位面积阳性细胞数进行定量分析。
1.3 胶原纤维的面密度测定 由同一专业技术人员在单盲、同一设定条件下，利用计算机辅助病理图象分析系统测定胶原面积，以此数据作为胶原蛋白定量分析结果。VG组织切片染色结果，胶原纤维显鲜红色，肌纤维、胞质及红细胞黄色，胞核蓝褐色。在正常组织和瘢痕组织标本四角和中央位置，随机选取5个视野，测定红色之胶原纤维面密度，计算平均值。
1.4 统计学处理 实验数据用均数±标准差(±s)表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 尿道瘢痕组织与正常尿道组织中TGFβ1的表达 TGFβ1在尿道狭窄组织中的表达较强(图1A)，主要集中在瘢痕成纤维细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞的胞浆和胞膜。本组16例标本中9例TGFβ1表达为()，7例表达为()，TGFβ1阳性表达率为100.0%；正常尿道组织中TGFβ1表达较弱(图1B)，本组6例标本中2例表达为(+)，4例表达为(-)，阳性表达率为33.3%。两组比较差异有显著性(P<0.05)。
2.2 尿道瘢痕组织与正常尿道组织中胶原蛋白含量测定 VG染色切片光镜下观察：胶原纤维呈红色，于细胞间散在分布。尿道瘢痕组织中胶原纤维粗大，密集成束或成行状排列(图2A)，计算胶原纤维的面密度值为(49.30±7.71)%。正常尿道组织中胶原纤维分布较稀疏，交织成网状，纤维较细腻(图2B)，计算胶原纤维的面密度值为(28.51±6.18)%。两组胶原纤维的面密度值比较差异有显著性(P<0.05)。图1 TGFβ1在尿道组织中的表达(略)图2 尿道组织中胶原纤维的VG染色(略)
3 讨 论
尿道狭窄的病理学改变是创面过度修复，产生增生性瘢痕，进而破坏尿道完整性，造成功能障碍。1993年Baskin等发现狭窄尿道的海绵体已被大量含纤维母细胞的结缔组织所替代，狭窄与正常尿道组织的本质区别在于Ⅰ、Ⅲ型胶原的比例不同。Morgia等证实尿道狭窄的病变部位在间质，与成纤维细胞活化引发大量胶原组织形成有关。TGFβ为超基因家族，在哺乳动物中只有3种形式，即TGFβ1-TGFβ3，其中TGFβ1在体细胞系中的比例最高、活性最强,是目前已知与瘢痕形成关系最密切、最有代表性的生长因子。TGFβ1可以被许多游出的炎性细胞如淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞和血小板合成并释放，能够促进成纤维细胞大量合成Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅷ型胶原蛋白、弹性纤维和纤连蛋白。在愈合早期，TGFβ1有利于伤口肉芽组织的生长及修复，但上皮愈合后局部TGFβ1持续高表达则被认为是继发瘢痕形成的重要因素。
本次实验材料均为尿道损伤后3-6个月的创面愈合标本。研究结果显示，TGFβ1蛋白在尿道狭窄瘢痕组织中的阳性表达率明显高于正常尿道组织(P<0.05)，证实TGFβ1的高表达与瘢痕的产生关系密切，是尿道狭窄发生的重要因素。本研究结果还显示尿道狭窄瘢痕组织中的胶原面密度值显著高于正常尿道组织，提示胶原合成增多与成熟加快是增生性瘢痕的又一重要表现。有报道认为TGFβ1可诱导α2平滑肌肌动蛋白在成纤维细胞中的表达，刺激Ⅰ型胶原纤维合成，同时通过胶原酶选择性地操控Ⅲ型胶原纤维的合成，使Ⅰ、Ⅲ型胶原比率上升，这一结果与瘢痕形成密切相关。尿道狭窄组织中TGFβ1持续表达较强的原因尚不完全清楚，可能与创面受尿液刺激作用引起的管壁慢性炎症有关。炎症反应持续存在造成上皮愈合后巨噬细胞仍大量聚集，持续合成、分泌TGFβ1等生长因子，导致成纤维细胞增殖旺盛，胶原过度合成，管腔瘢痕化。推测抑制TGFβ1基因的过度表达及抑制其活性，将有助于预防或减轻瘢痕形成。此举将从分子生物学角度为防治瘢痕性尿道狭窄提供一条新的思路和途径。
参考文献：
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(西安交通大学医学院第二附属医院：1. 泌尿外科；2. 病理科； 3. 信息图书资料中心，陕西西安 710004)
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