甲状腺肿瘤蛋白质组学研究进展
 |
| 第1页 |
参见附件(313KB，4页)。
摘要：蛋白质组学是在后基因组时代出现的一个新的研究领域，肿瘤蛋白质组学是其重要分支。本文从甲状腺肿瘤特异性分子标志物以及甲状腺癌治疗的分子靶点等几个方面，详细介绍了近几年来甲状腺肿瘤蛋白质组学的研究现状。
关键词：甲状腺癌；肿瘤蛋白质组学；二维凝胶电泳；质谱
Progress in research of thyroid oncoproteomics
Shi Bingyin, Li hao
(Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)
ABSTRACT: Proteomics is a new research area of the postgenomic era. Oncoproteomics is an important branch of it. Here we discuss the investigative outcome of thyroid oncoproteomics in recent years, such as specific tumor biomarkers and antineoplastic drug.
KEY WORDS: thyroid cancer; oncoproteomics; twodimensional electrophoresis; mass spectrometry
甲状腺癌是内分泌肿瘤中最常见的一种，目前已从基因水平对其进行了广泛研究，但基因的功能最终需要通过相应的蛋白质发挥作用，而在DNA→mRNA→蛋白质的转录及翻译过程中存在转录后剪切、翻译后修饰加工等多种方式，所以基因与蛋白质的表达之间存在着一定差异，有必要从蛋白质整体水平揭示肿瘤的发生发展，阐述其癌变本质。肿瘤蛋白质组学借助蛋白质组学研究技术，如二维凝胶电泳(twodimensional electrophoresis, 2DE)，电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry, ESIMS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassisted laser desorption ionization timeofflight mass spectrometer, MALDITOFMS)等，可动态、整体、定量的考察甲状腺癌发生发展过程中蛋白质种类、数量的改变，比较肿瘤细胞与正常细胞蛋白质的表达差异，帮助研究者寻找用于肿瘤诊断及指导治疗的特异性分子标志物[1]。现将近几年来甲状腺肿瘤蛋白质组学的研究进展介绍如下。
1 诊断甲状腺肿瘤的特异性分子标志物
1.1 Galectin3 Galectin3(Gal3)是β半乳糖苷酶结合蛋白家族成员，分子质量为31ku，主要存在于细胞质中，亦可位于胞膜及胞核。已有研究证明[2]，Gal3可作为甲状腺恶性肿瘤特别是甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)的一个表型特征，考虑Gal3的表达和PTC细胞保持高度增殖活性有关，但其具体作用机制仍不明确。Paron等[3]利用2DE和MALDIMS方法研究大鼠甲状腺细胞系FRTL5和Kiras癌基因转化细胞系Kimol的细胞核蛋白质表达差异，发现Gal3过度表达于Kimol中，而在FRTL5中不表达。研究表明Gal3通过和甲状腺转录因子(thyroid transcription factor1, TTF1)的同源结构域相互作用使TTF1的转录活性上调，其N末端还可和细胞内的单链DNA及RNA结合。TTF1是NKx型蛋白的一种，这些蛋白具有高度保守的同源结构域序列，故NKx同源盒基因家族其他成员也可和Gal3相互作用。TTF1是甲状腺特有的甲状腺球蛋白和甲状腺过氧化物酶基因转录的调控因子，它的表达水平和甲状腺细胞增殖水平成正比。Gal3通过和TTF1的相互作用调控甲状腺细胞的生长分化过程，在肿瘤的转化和转移方面起重要作用。
1.2 DDIT3、ARG2、ITM1和C1orf 24 Cerutti等[4]在研究甲状腺滤泡癌和滤泡性腺瘤的蛋白质表达差异过程中，发现4种蛋白质的表达有统计学意义。它们分别为DNA损伤诱导转录因子3(DNA damageinducible transcript 3, DDIT3)、2型精氨酸酶(arginase type Ⅱ, ARG2)、膜整合蛋白1(integral membrane protein 1, ITM1)和1号染色体开放读码框架24又名niban蛋白(chromosome 1 open reading frame 24, C1orf 24)。进一步利用免疫组化方法研究发现，85.2%(23/27)的甲状腺滤泡癌DDIT3和ARG2的表达均为阳性，而甲状腺滤泡型腺瘤DDIT3和ARG2双阳性率仅为9.4%(3/32)，联合检测DDIT3和ARG2诊断甲状腺滤泡癌，准确率可达83%。DDIT3在细胞应激及DNA损伤修复时表达，细胞内RAS和PAX8PPARG通路亦可激活其表达，推测DDIT3和肿瘤细胞的恶性增殖及浸润性有关[5]。ARG2是精氨酸酶同工酶的一种，位于线粒体内，可将精氨酸水解为鸟氨酸及尿素，而鸟氨酸可以脱羧生成腐胺，然后转变为多胺。多胺是重要的生物学调控物质，在细胞分化、细胞周期的调节中起关键作用。精氨酸酶活性增加可导致细胞内鸟氨酸水平升高，进而促使癌症发生。ITM1是一个高度保守的蛋白，推测它是一种新型通透酶。C1orf24分布于骨骼肌、胰腺及前列腺内，在甲状腺癌中的作用尚不明确。
1.3 组织蛋白酶B Srisomsap1等[6]利用2DE对多种甲状腺疾病组织的蛋白质表达情况进行了研究,共分离出32个特异性蛋白质点，分子质量在15-30ku之间，等电点在4.5-6.5左右。这些蛋白质功能各有不同,包括参与构成细胞骨架的相关蛋白(肌动蛋白、原肌球蛋白、肌球蛋白)和蛋白构象改变有关的蛋白质——热休克蛋白27，与转录及翻译有关的蛋白(核苷二磷酸激酶、延长因子1β)以及超氧化物岐化酶、组织蛋白酶B(cathepsin B, CB)等。CB是细胞溶酶体中的一种半胱氨酸蛋白酶，可降解层连蛋白、纤连蛋白、IV 型胶原等细胞外基质成分。研究表明, CB在乳腺癌、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中表达上调，且活性明显升高[7]。肿瘤细胞CB的表达上调及活性增强有助于降解基底膜主要成分——层粘蛋白和IV 型胶原，同时CB通过激活其他蛋白酶如胶原酶、尿激酶等产生协同作用使肿瘤易于侵袭及扩散。利用ESIMS分析CB，结果显示有4个特异性的斑点：CB1、CB2、CB3、CB4，其中CB2、CB3在甲状腺滤泡型腺瘤、PTC和甲状腺滤泡癌中的表达明显上调，而在结节性甲状腺肿和Graves病中表达减低。提示可以通过检测CB水平鉴别那些在显微镜下难以区分的甲状腺滤泡型腺瘤和结节性甲状腺肿。
1.4 MnSOD Russo等[8]研究发现甲状腺乳头状癌细胞系TPC1和甲状腺未分化癌细胞系ARO的细胞核蛋白质2DE电泳图谱大致相似，其中有一个蛋白质点较为特殊，在TPC1中的表达显著升高，而在ARO中检测不出。利用MALDIMS肽质谱指纹鉴定后证实该蛋白为锰超氧化物岐化酶(Mn superoxide dismutase, MnSOD)，免疫组化法表明MnSOD在正常甲状腺细胞的胞浆及胞核内均有表达，在PTC及甲状腺滤泡癌的胞核内表达水平明显降低，而在甲状腺未分化癌中几乎不表达，提示MnSOD可作为诊断甲状腺未分化癌的分子标志物。MnSOD在甲状腺细胞内的表达由TSH通过不依赖cAMP的途径调控。它可以有效清除胞内氧自由基，影响细胞信号传导通路，并可在基因水平调节转录因子的活性。考虑MnSOD在细胞核内表达水平的改变同细胞失去分化功能及具有侵袭性的改变是一致的，所以认为MnSOD可能是一种肿瘤抑制物，通过多种途径诱导细胞凋亡。
1.5 Maspin Boltze等[9]利用蛋白质组学方法研究原代培养的甲状腺细胞(primary cultured thyrocytes, PT)及2.0Gyα粒子照射PT后的转化细胞(transformed thyrocytes, TT)的蛋白质表达差异。TT在生长动力学方面显示出与PT巨大的差别，包括缺少接触抑制，分化较差等。利用2DE电泳技术分析PT和TT的蛋白质表达，分别分离出1220±43和1228±55个蛋白质点，其中554号蛋白质点较为特殊(分子质量39606u，等电点5.90)，其表达丰度在TT中显著升高，经MALDIMS肽质谱指纹鉴别后证实该蛋白为Maspin蛋白。Maspin是一种抑制肿瘤的丝氨酸蛋白酶抑制剂[10]。研究表明Maspin和p53基因相互作用，在体外和体内抑制血管生成。免疫组化法证明Maspin蛋白可特异性的高表达于PTC,表达率为70%，而在正常甲状腺组织及其他几种甲状腺癌组织中几乎不表达。Ito等[11]研究证明，Maspin在分化较差的PTC细胞中的表达显著增多，而在分化较好的PTC细胞中的表达则相对减少。推测Maspin在PTC的发生和转归方面起着重要作用,但其具体作用机制仍有待进一步的研究[12]。
2 治疗甲状腺肿瘤的分子靶点研究
Paron等[13]利用2DE和MALDITOFMS方法研究大鼠甲状腺细胞p53基因突变株的蛋白质表达差异，大约有300个特异性蛋白质点被分离出，其中2个热休克家族的蛋白质，热休克蛋白90(Hsp 90)和热休克蛋白60(Hsp 60)表达上调，研究发现Hsp 90表达上调和哺乳动物的细胞增殖功能及p53突变株的稳定性密切相关，故Hsp 90可在癌细胞中过度表达。目前一系列以Hsp 90为靶点的抗癌药物正在研制当中[14]，其中Hsp 90抑制剂格尔德霉素的衍生物17烯丙胺17脱甲氧格尔德霉素(17allylamino17demethoxygeldanamycin, 17AAG)在英国和美国已进入Ⅰ期临床试验。格尔德霉素可以特异性地作用于Hsp 90的ATP结合位点，抑制其ATPase活性，还可以通过调节Hsp 90的表达而发挥作用。Park等[15]研究发现格尔德霉素可以抑制甲状腺癌细胞的增殖，使突变的p53基因表达下调，并且抑制表皮生长因子介导的癌细胞浸润行为。Marsee等[16]研究证明，格尔德霉素可以通过减少甲状腺细胞对碘的清除作用来提高其浓集碘的能力，提示格尔德霉素可以作为131I治疗甲状腺癌的辅助药物。BragaBasaria等[17]将17AAG加入到各种甲状腺癌细胞系的培养基中后发现，在0.1mmol/L 17AAG的培养基中培养72h后，甲状腺乳头状癌细胞生长部分受抑，甲状腺滤泡癌细胞生长完全受抑，甲状腺未分化癌细胞大量死亡，故甲状腺未分化癌细胞对17AAG的细胞毒性作用最敏感，而乳头状癌细胞的敏感性最差，且癌细胞对17AAG的敏感程度和胞内Hsp 90水平成正相关。进一步研究发现17AAG只能促使甲状腺癌细胞死亡，而不能诱导其凋亡,推测甲状腺癌细胞抗凋亡的机制可能和抑癌基因的突变有关。目前对格尔德霉素治疗甲状腺癌的研究仅限于基础理论方面，尚未有动物实验报道。
3 甲状腺乳头状癌细胞膜表面糖基化大分子的研究
研究表明，PTC细胞膜表面成分可被硫酸角质素(keratan sulfate, KS)异常糖基化，Magro等[18]利用抗KS抗原决定簇的单克隆抗体(373E1)研究了各种甲状腺组织中KS的表达情况。结果显示PTC的免疫组化染色阳性率为100%，且和组织学分型、瘤体大小、有无转移无关。甲状腺滤泡癌的免疫组化阳性率仅为21%，其他甲状腺组织几乎不表达KS结合蛋白成分。通过蛋白质组学技术，证明PTC特异性KS结合蛋白是甲状腺球蛋白(thyroglobulin, Tg)和转铁蛋白(transferrin, TF)的特殊糖化形式，且KS糖化型Tg在PTC的表达较KS糖化型TF多，二者相对比为11.8∶1。进一步研究发现，KS糖化型Tg和TF因其特殊糖化形式和较大的分子质量，与正常Tg和TF相比，表现为不同的活体内蛋白水解形式，KS糖化型Tg可保护自身不被组织蛋白酶K、梭菌蛋白酶及凝血酶分解，一些KS糖化型Tg的蛋白水解片段被鉴别后证实，和PTC特异性癌胚蛋白纤维结合素有相似的分子质量。KS糖化型Tg为甲状腺癌的研究提供了方便，对于那些术后需要长期监测血清Tg水平的PTC患者，未来可以监测更为特异性的血清KS糖化型Tg水平来评估病人的预后。
4 展望
目前，国内外肿瘤蛋白质组学研究正在蓬勃开展，其中结肠癌、乳腺癌的蛋白质数据库已建设完成，人们可直接在互联网上查询。肿瘤蛋白质组学在研究肿瘤发病机理、发现抗肿瘤药物的作用靶点、新药筛选与药物毒副作用分析等方面有巨大的实用价值。相对于其他实体肿瘤，甲状腺癌的蛋白质组学研究起步较晚，随着蛋白质组学技术平台和生物信息学的发展完善，基因组学、基础肿瘤学等各学科的优势发挥和有效衔接，最终将会描绘出甲状腺肿瘤的蛋白质网络，建立癌细胞和正常细胞信号传导通路的数学模型，利用这一模型，研究者可以发现新的蛋白质，了解各类信号传导通路在细胞生长、分化、成熟以及凋亡过程中的作用，进而为甲状腺肿瘤的诊断及干预治疗提供分子基础[19]。
参考文献：
[1]Alaiya A, AlMohanna M, Linder S. Clinical cancer proteomics: promises and pitfalls [J]. J Proteome Res, 2005,4(4):12131222.
[2]Cvejic D, Savin S, Petrovic I, et al. Galectin3 expression in papillary microcarcinoma of the thyroid [J]. Histopathology, 2005,47(2):209214.
[3]Paron I, Scaloni A, Pines A, et al. Nuclear localization of Galectin3 in transformed thyroid cells: a role in transcriptional regulation [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2003,302(3):545553.
[4]Cerutti JM, Delcelo R, Amadei MJ, et al. A preoperative diagnostic test that distinguishes benign from malignant thyroid carcinoma based on gene expression [J]. J Clin Invest, 2004,113(8):12341242.
[5]Nikiforova MN, Lynch RA, Biddinger PW, et al. RAS point mutations and PAX8PPAR gamma rearrangement in thyroid tumors: evidence for distinct molecular pathways in thyroid follicular carcinoma [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2003,88(5):23182326.
[6]Srisomsap IC, Subhasitanont IP, Otto A, et al. Detection of cathepsin B upregulation in neoplastic thyroid tissues by proteomic analysis [J]. Proteomics, 2002,2(6):706712.
[7]LamparskaPrzybysz M, Gajkowska B, Motyl T. Cathepsins and BID are involved in the molecular switch between apoptosis and autophagy in breast cancer MCF7 cells exposed to camptothecin [J]. Physiol Pharmacol, 2005, 56(3):159179.
[8]Russo D, Bisca A, Celano M, et al. Proteomic analysis of human thyroid cell lines reveals reduced nuclear localization of MnSOD in poorly differentiated thyroid cancer cells [J]. J Endocrinol Invest, 2005, 28(2):137144.
[9]Zhang M, Shi Y, Magit D, et al. Reduced mammary tumor progression in WAPTag/WAPmaspin bitranspenic mice [J]. Oncogene, 2000,19(52):60536058.
[10]Chen EI, Florens L, Axelrod FT, et al. Maspin alters the carcinoma proteome [J]. FASEB J, 2005,19(9):11231124.
[11]Ito Y, Yoshida H, Tomoda C, et al. Maspin expression is directly associated with biological aggressiveness of thyroid carcinoma [J]. Thyroid, 2004,14(1):1318.
[12]Boltze C, SchneiderStock R, Quednow C. Proteome analysis identified maspin as a special feature of papillary thyroid carcinoma [J]. Int J Oncol, 2003,23(5):13231328.
[13]Paron I, Ambrosio CD, Scaloni A, et al. A differential proteomic approach to identify proteins associated with thyroid cell transformation [J]. J Mole Endocrinol, 2005,34(1):199207.
[14]Workman P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone [J]. Cancer Letters, 2004,206(2):149157.
[15]Park JW, Yeh MW, Wong MG, et al. The Heat Shock Protein 90binding Geldanamycin inhibits cancer cell proliferation, downregulates oncoproteins, and inhibits Epidermal Growth Factorinduced invasion in thyroid cancer cell lines [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2003,88(7):33463353.
[16]Marsee DK, Venkateswaran A, Tao H, et al. Inhibition of heat shock protein 90, a novel RET/PTC1associated protein, increases radioiodide accumulation in thyroid cells [J]. J Biol Chem, 2004,279(42):4399043997.
[17]BragaBasaria M, Hardy E, Gottfried R, et al. 17Allylamino17demethoxygeldanamycin activity against thyroid cancer cell lines correlates with heat shock protein 90 levels [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2004,89(6):29822988.
[18]Magro G, Perissinotto D, Schiappacassi M, et al. Proteomic and postproteomic characterization of Keratan SulfateGlycanated isoforms of thyroglobulin and transferrin uniquely elaborated by papillary thyroid carcinomas [J]. Am J Pathol, 2003, 163(1):183196.
[19]Maurer MH. The path to enlightment: making sense of genomic and proteomic information [J]. Geno Prot Bioinfo, 2004, 2(2):123131.
(编辑 韩维栋)
基金项目：国家十五攻关资助项目(No.2004BA720A320)
(西安交通大学医学院第一附属医院内分泌科，陕西西安 710061)
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(313KB，4页)。