新生小鼠睾丸组织异体异位移植物中精子形态及功能的研究
 |
| 第1页 |
参见附件(295KB，4页)。
摘要：目的 采用卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)技术探讨新生小鼠睾丸组织异体异位移植到裸鼠体内后所生成精子的受精能力。方法 将含有原始生精细胞的新生1-2d小鼠睾丸组织异体异位移植到BALB/c-nu/nu免疫缺陷小鼠背部皮下。8周后取出移植物，通过常规染色和电镜技术对生精小管中生精细胞组成和形态进行观察；以薄层明胶水解法检测精子顶体蛋白酶活性；采用ISCI技术检测移植物中具有成熟形态精子的受精能力。结果 移植物的HE染色发现，新生小鼠睾丸组织在裸鼠体内已启动并进行精子发生过程，生精小管中含有包括精子在内的所有类型生精细胞；移植物组织经处理后，可计数到具有镰刀头状的长尾精子约1×103个/mg移植物；透射电镜标本中观察到的精原细胞和精母细胞均具有正常超微结构；薄层明胶水解法检测可观察到顶体蛋白酶呈阳性反应的精子；ICSI结果显示，单纯ICSI处理组与ICSI+电激活组均有受精和卵裂现象发生。结论 仅含有原始生精细胞的新生小鼠睾丸组织在异体异位移植到裸鼠体内后，可以产生形态正常并具有受精能力的精子。
关键词：睾丸组织；异体异位移植；精子；卵胞浆内单精子显微注射；新生小鼠
Functional study of spermatozoa derived from neonatal mouse testes grafted into immunodeficient mice
Zhang Fangting, Yu Jie, Cai Zhiming, Fang Jiazhi, Wan Huijuan, Ye Jing, Yin Meijun
(Central Laboratory, Beijing University Shenzhen Hospital; Laboratory of Male Reproduction, Beijing University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, China)
ABSTRACT: Objective To investigate the fertilization ability of spermatozoa derived from neonatal mouse testes grafted into immunodeficient mice by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Methods Neonatal Kunming mouse testes containing primitive spermatogenic cells as the only germ cells were grafted under the back skin of castrated BALB/cnu/nu mice. Grafts were taken out after 8 weeks. The initiation and restoration of spermatogenesis in grafts was documented by histological analyses. The ultrastructure of spermatogenic cells in grafts was observed using transmission electron microscopy. The activity of acrosomal enzyme of spermatozoa was analyzed with gelatin substrate test. The fertilization ability of spermatozoa was determined by using intracytoplasmic sperm injection. Results Histological analysis showed complete restoration of spermatogenesis in the grafts after 8 weeks. 1×103 spermatozoa with normal morphological appearance in 1mg suspended graft tissue were counted. Spermatogonia and spermatocytes with normal ultrastructure were observed. Gelatin substrate test positive spermatozoa were found implicating the activity of acrosomal enzyme of the spermatozoa. Cleavages were observed both in the ICSI group and the ICSI plus electric stimulation group. Conclusion Spermatozoa with normal morphology and fertilization ability can be developed by allografting neonatal mouse testes under the back skin of immunodeficient mice.
KEY WORDS: testis; allograft; spermatozoa; intracytoplasmic sperm injection; neonatal mouse
有关生精细胞体外成熟的研究目前主要是通过体外培养和生精细胞移植来实现。其中在借助免疫缺陷小鼠作为孵化器进行同种或异种睾丸组织移植，以实现生精细胞在异体异位发育成熟方面国外学者已做了一些工作[13]。本研究组在前期工作中，将新生小鼠睾丸组织移植到去势免疫缺陷小鼠体内，40d后在移植物中观察到了精子的发生[4]，在采用人类未成熟睾丸组织所进行的同类实验中也观察到了生精细胞的进一步发育[5]。在前期工作基础上，本研究采用薄层明胶水解法、透射电镜和卵胞浆内单精子显微注射技术，对所获得的移植物中生精细胞的超微结构、精子的顶体酶活性及其受精能力等方面进行了进一步的观察和研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物 BALB/cnu/nu无胸腺裸小鼠和昆明小鼠均购自南方医科大学实验动物中心，裸鼠置于小鼠单体换气笼盒系统内饲养，昆明小鼠按常规方法饲养及传代。
1.2 主要试剂 透明质酸酶、牛血清白蛋白、乳酸钠、丙酮酸钠均为Sigma产品；体外卵培养用石蜡油为SAGE Media 产品；孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)分别购于天津生物制品研究所和上海生化制药厂；卵培养用CZB培养液、1.7mmol/L 氯化锶激活液以及精子处理液为QUINNS产品。
1.3 方法
1.3.1 组织移植和移植物标本采集 参照文献[4]进行新生小鼠睾丸组织移植。于移植后8周取2只受体动物行脱颈处死，将背部的移植物包块取出，一部分用于常规染色和电镜标本的制备，其余部分在HEPESCZB培养基中切碎，用吸管反复吹打，过100μm滤网去除大块组织，在1200r/min下离心10min，用培养液制成细胞悬液，在光镜下进行长尾精子计数。
1.3.2 组织学标本制备 将取出的移植物组织分别用4℃预冷的Bouin液和25g/L戊二醛溶液固定，分别用于常规HE染色和透射电镜标本制备(电镜标本由广州南方医科大学分析测试中心制作、分析并照相)。
1.3.3 移植物中精子顶体蛋白酶活性检测(薄层明胶水解法) 取40μL细胞悬液，尽量均匀涂布在已预先制备的涂有50g/L明胶的载波片上；干燥后放入湿盒内，37℃孵育2h；然后用相差显微镜观察精子头部呈环的情况。作为阳性对照，也用正常性成熟小鼠睾丸精子进行同样实验。
1.3.4 卵胞浆内单精子显微注射 ①卵子准备：6周龄雌性昆明小鼠4只，腹腔注射5u/mL的PMSG，48h后腹腔注射5u/mL的HCG行超排卵，并于注射HCG 16-18h后将小鼠脱颈处死，于输卵管膨大部收集卵丘卵母细胞团；用含1g/L透明质酸酶的HEPESCZB处理3-5min去除卵丘细胞；经洗涤后置于CZB液中，置37℃、5%(体积分数)CO2培养箱孵育备用。②显微操作：将从移植物获得的细胞悬液于1500r/min下离心10min，去上清，沉淀用精子处理液洗涤2次，用500μL精子处理液制成ICSI用细胞悬液，置37℃、5%(体积分数)CO2培养箱孵育1-2h；将处理好的细胞悬液在ICSI皿中制成小滴，每滴约10-20μL，从中选取形态发育正常的精子移至100g/L PVP中，洗涤去除膜上杂质；机械法去除2/3精子尾部后，将带有精子头部的剩余部分注射入MII期的卵子的胞浆中。将注射后的卵子转入CZB培养液中，置37℃、5%(体积分数)CO2培养箱孵育并将其分为2组，单纯ICSI组(显微注射后未加电激活)和ICSI加电激活组(注射后的卵子行电激活处理1h)，定期观察两组卵的受精和卵裂情况。
2 结果
2.1 移植物的组织形态学及超微结构观察 经计数，移植物中带有镰刀状头部的长尾精子数量为1×103个/mg移植物组织(图1A)。常规HE染色观察显示，移植8周后的新生小鼠睾丸组织在裸鼠体内已启动了精子发生过程，发育成包含所有生精细胞类型的生精小管上皮(图1B)。在对移植物标本进行的超微结构观察中，虽未直接观察到已发育成的精子，但可见一些结构正常的生精细胞，包括精原细胞和精母细胞等(图1C)。
2.2 精子顶体蛋白酶活性 由于精子头部所含顶体蛋白酶对涂布于载玻片上明胶的水解作用，在精子头部周围区域观察到一圈较明亮的晕轮区。实验中发现，移植物中可见顶体蛋白酶水解反应阳性的精子(图2A)，但与作为对照的正常小鼠睾丸精子相比(图2B)，移植物精子头部周围的晕轮区域普遍较小并可见到数量较多的顶体蛋白酶水解反应阴性的精子(图2C)。
2.3 卵胞浆内单精子显微注射 经超排卵和处理后获MII期卵母细胞54枚。单纯ICSI组15枚，ICSI加电激活组39枚。实验发现，ICSI加电激活组的受精率为43.6%，其中观察到2原核2极体共9枚，随后观察到2细胞17枚、4细胞12枚以及8细胞1枚；单纯ICSI组受精率为20.0%，出现2原核并排出极体的时间比ICSI加电激活组晚10h左右，随后观察可见2细胞3枚；4细胞1枚(图3)。
图1 移植物的组织形态学及超微结构观察(略)
Fig.1 Morphological, histological and ultrastructural observation on grafts
A: falciform headed mouse sperm (red↑) in the grafts (×100)；B: photomicrograph of histological section of the grafts used for ICSI showing a complete restoration of spermatogenesis (HE×400)；C: electron micrograph showing part of the seminiferous epithelium composed of basement membrane (red↑), type–B spermatogonia (yellow↑) and spermatocytes (blue↑) with normal ultrastructure (×3000)
图2 顶体酶活性测定(略)
Fig.2 Determination of acrosomal enzyme activity with the gelatin substrate method (×400)
A: a spermatozoon from the graft creating a zone of proteolysis around the head; B: a spermatozoon from normal adult mouse showing a wider zone of proteolysis; C: a spermatozoon without acrosomal enzyme activity
图3 移植物中精子进行ICSI后卵裂情况观察(略)
Fig.3 Observation on cleavage after ICSI with sperm from the grafts
A: 2 pronuclei and 2 polar bodies (×400); B: asynchronous cleavage at the day 2(×100); C: the fourcell and eightcell stage at the day 3 (×100)
3 讨论
对于因精子发生阻滞而导致生精障碍的患者来说，如何克服体内发育障碍，使本身具有的原始生精细胞在体外特定环境中进一步发育成为长形精子细胞或精子，是目前男科学工作者致力解决的问题。Honaramooz等[1]2002年首次报道采用免疫缺陷动物作为受体进行睾丸组织异体异位移植研究。国内在2004年报道了采用该动物模型进行的新生小鼠睾丸组织和人胎儿睾丸组织的生长发育观察[45]，并在小鼠的实验中观察到了从原始生精细胞到精子的完整生精过程。本研究是在前期研究工作基础上，对采用该动物模型所获得的小鼠精子进行的一系列功能性研究。
与在体情况不同，睾丸组织移植物中产生的精子无法通过附睾排出；此外，FSH等激素的水平亦与正常动物中有所不同[2]。前期实验发现，移植后5周的移植物中已出现各级生精细胞，包括一定数量的长形精子细胞，第6-8周达到发育的高峰，之后不仅不再继续发展，生精小管甚至开始出现退化，Sertoli细胞的胞浆明显萎缩，嵌入其中的生精细胞(包括晚期精母细胞、圆形精子细胞和长形精子细胞等)大量脱落，并发生凋亡。因而移植物中精子的最佳取出时间也是ICSI成功与否的一个重要因素。据此，本研究选取8周移植物中的精子作为受精能力检测的标本来源，并成功观察到卵裂的发生。
精子形成过程中顶体的发育是重要的事件之一。朱伟杰等[6]研究证实，睾丸精子已初步发育出具备活性的顶体蛋白酶，其酶活性阳性率超过50%。对睾丸精子顶体酶活性的检测不仅可以评价睾丸精子顶体酶发育情况，还有助于了解睾丸精子的降解程度，这对于我们了解移植物中精子发育状况和确定最佳移植物取出时间尤为重要。薄层明胶水解法能够观察极少量标本甚至单个精子的顶体酶活性情况，其基本原理为精子头部所含顶体蛋白酶对其周围明胶的水解作用，使其周围形成一圈明亮的晕轮区，通过测量其直径可以间接了解顶体酶活性情况。本实验中发现，移植物含有顶体蛋白酶反应阳性的精子，但数量相对正常阳性对照少，所形成的晕轮区域也相对较小。精子发生经历增殖、减数分裂和分化等复杂过程，这些过程均有可能由于急性睾丸缺血、输精管缺如、促性腺激素水平改变等造成生精细胞的凋亡[78]。类似于先天性输精管缺如，移植于裸鼠背部的睾丸缺乏精子的正常输出通道，因而导致产生的精子滞留时间长，诱发凋亡甚至死亡，这也是造成精子计数和顶体蛋白酶活性偏低的原因之一。
通过自然生精过程发育成熟的精子可以使成熟的卵母细胞受精,而未成熟睾丸组织通过异体异位移植后所产生的精子是否也具有同样的功能？为此，本研究将睾丸组织移植物中形态发育正常的精子注入到成熟的MII期卵母细胞胞质中，并辅以电激活。实验中观察到有2原核和4细胞胚胎出现。为排除电激活步骤有可能造成孤雌生殖的可能性，我们设立了单独ICSI组作为对照。结果显示，单独ICSI也成功形成了2原核以及渡过了2细胞期和4细胞期，但受精时间要比第一组晚约10h。与正常受精有所不同，采用显微注射的方法使精子进入卵子，省略了自然受精时精子需经过的许多环节，因此往往不能获得理想的精卵融合。研究显示，将卵母细胞激活，有利于注入的精子细胞融合及受精卵的发育。因此，本研究中采用了ICSI辅以电激活的方法，受精率为43.6%。而单纯ICSI组受精率为20.0%，并且未观察到胚胎发育至8细胞。胚胎的进一步发育和胚胎的结局以及未成熟小鼠睾丸组织异体异位移植后所产生精子基因水平的检测分析还有待进一步研究探讨。
致谢：陈大元教授、欧阳迎春博士和蒋满喜博士等(中科院动物所生殖生物学实验室，北京 100080)在ISCI操作方面给予了极大帮助，本文作者在此表示衷心的感谢。
参考文献：
[1]Honaramooz A, Snedaker A, Boiani M, et al. Sperm from neonatal mammalian testes grafted in mice [J]. Nature, 2002, 418(6899):778781.
[2]Schlatt S, Honaramooz A, Boiani M, et al. Progeny from sperm obtained after ectopic grafting of neonatal mouse testes [J]. Biol Reprod, 2003, 68(6):23312335.
[3]Honaramooz A, Li MW, Penedo MC, et al. Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice [J]. Biol Reprod, 2004, 70(5):15001503.
[4]于洁，蔡志明，叶静，等. 小鼠原始生精细胞裸鼠皮下移植动物模型的制作 [J]. 中华器官移植杂志，2005, 26(5):297299.
[5]于洁，叶静，张芳婷，等. 胎儿睾丸组织异体移植后生精细胞发育初探 [J]. 中华男科学杂志, 2004, 10(12):902906.
[6]朱伟杰，梁蔚波，金庆骝. 人类睾丸精子和附睾精子的顶体蛋白酶活性 [J]. 中国病理生理杂志, 1998, 14(5):465468.
[7]Turner TT, Tung KS, Tomomasa H, et al. Acute testicular ischemia results in germ cellspecific apoptosis in the rat [J]. Biol Reprod, 1997, 57(6):12671274.
[8]Luey KY, Kam KM. Vaccine coverage of Streptococcus pneumoniae in Hong Kong with attention to the multipleantibioticresistant strains [J]. Vaccine, 1996,14 (1718):15731580.
(编辑 卓选鹏)
基金项目：广东省自然科学基金资助项目(No.04007312)；深圳市科技计划项目(No.200404101)
(北京大学深圳医院中心实验室；北京大学深圳医院男性生殖实验室，广东深圳 518036)
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(295KB，4页)。