扁桃酸对小鼠体内弓形虫速殖子的作用机制
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摘要：目的 探讨扁桃酸在小鼠体内抗弓形虫速殖子的作用机制。方法 给予弓形虫感染的小鼠口服扁桃酸200mg/kg，2次/d，然后在不同时间取腹水及肝脏制作电镜标本，观察弓形虫的超微结构变化。结果 腹水中游离弓形虫速殖子和肝组织内弓形虫速殖子的超微结构均发生明显改变，细胞膜迂曲破裂，线粒体、内质网扩张破裂，棒状体肿胀破裂，致密颗粒减少或消失，核膜迂曲破裂，核固缩。扁桃酸实验组小鼠肝细胞的受损程度明显轻于阳性对照组和乙胺嘧啶药物对照组的肝细胞改变。结论 通过形态学观察，发现扁桃酸的作用机制主要表现在其对虫体细胞膜、入侵细胞器及细胞核等结构的破坏，导致虫体崩解或抑制虫体的繁殖。
关键词：扁桃酸；弓形虫；速殖子；超微结构
The mechanism of mandelic acid against toxoplasmic tachyzoite in vitro
Si Kaiwei, Cheng Yanbin, Li Zhe, Li Xiaoqi, Yang Junhua, Li Chen
(Department of Immunology and Pathogenbiology, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)
ABSTRACT: Objective To study the mechanism of mandelic acid against toxoplasmic tachyzoite in mice. Methods Mandelic acid (200mg/kg, twice daily) was orally given to the infected mice; and the ascites and liver tissue were taken at different time to make electromicroscopic sample in order to observe the microstructure changes of toxoplasmic tachyzoite. Results Microstrctures of toxoplasmic tachyzoite, either in ascites or in liver tissue, were obviously changed. It mainly showed that: cell membrane was tortuous and broken, mitochondrial and endplasic reticulum were enlarged and broken, rhoptry was swollen and broken, dense granules decreased or disappeared, and nucleolus was contracted. Degree of liver damage in mandelic acid group was lighter than that in pyrimethine controlled group and positive group. Conclusion The mechanism of mandelic acid against toxoplasmic tachyzoite in morphology mainly shows that mandelic acid destroys the parasite cell membrane, invasive organs and nucleus et al, and thus causes worm destruction or inhibits the worm reproduction.
KEY WORDS: mandelic acid; toxoplasma; tachyzoite; microstructure
弓形虫病是由机会性致病原虫(刚地弓形虫)引起的人兽共患疾病[1]。弓形虫病对人类健康的危害日益严重。目前对弓形虫病的治疗仍以乙胺嘧啶和磺胺嘧啶联合应用为主，但其毒副作用限制了临床应用[2]。近年来应用生物制剂和中草药对弓形虫病的治疗取得了较大进展。而扁桃酸体内、外抗弓形虫疗效已被证实[34]，但其体内作用机制尚不清楚。我们着重从形态学上探讨了扁桃酸对小鼠体内抗弓形虫的作用机制。
1 材料与方法
1.1 弓形虫RH株 由中国农业科学院兰州畜牧医研究所寄生虫病科提供；扁桃酸由西安交通大学药学系合成；乙胺嘧啶由成都制药二厂生产。
1.2 实验动物 由西安交通大学医学院实验动物中心提供，系昆明株小鼠，90只，每只20-25g，随即分成三组，每组30只。
1.3 药物治疗 取弓形虫悬浊液(5.8×105/mL)给阳性对照组、扁桃酸治疗组、乙胺嘧啶对照组小鼠各0.25mL腹腔注射。于感染后2h，经口给予治疗组小鼠20g/L的扁桃酸溶液各0.25mL，2次/d，间隔6h；经口给予对照组小鼠5g/L的乙胺嘧啶悬浊液各0.25mL(用时充分混匀)，1次/d，连续治疗直至小鼠死亡。
1.4 标本制作 分别于感染后24、72h和死亡后，每组随即解剖小鼠各5只，取腹水离心沉淀物及小鼠肝组织，用2.5%(体积分数)戊二醛分别固定72h，然后按常规制作电镜标本，在HITACHI H600型透射电镜下观察并拍照。
2 结果
2.1 腹水中游离弓形虫速殖子超微结构的变化 阳性对照组:虫体呈香蕉形，细胞膜光滑完整，细胞质前端有类锥体和棒状体，线粒体和内质网形态结构完整，细胞质中可见较多的致密颗粒，核膜完整，染色质小块状散布于核质中(图1A)。扁桃酸治疗组:虫体超微结构的受损程度随药物作用时间的延长而明显加重，主要表现为虫体细胞膜迂曲断裂，棒状体肿胀破裂，致密颗粒明显减少或消失，线粒体肿胀，嵴消失，甚至絮状改变，内质网扩张破裂，核膜断裂，染色质明显凝集(图1B)。乙胺嘧啶对照组:虫体数量较少，虫体破坏程度较严重。主要表现为虫体胞膜迂曲，线粒体明显肿胀，粗面内质网碎裂，致密颗粒减少，核固缩，虫体电子密度降低(图1C)。
图1 腹水中游离弓形虫速殖子超微结构的改变(略)
Fig.1 The microstructure change of toxoplasma tachyzoite in ascites
A: In the positive control group, the morphogenesis of tachyzoite is complete, cell organs (mitochondrion, endplasic reticulum, rhoptry and dense granules et al) and cell nucleus is distinct (TEM ×17000)
B: In the Mandelic acide treated group, the cell membrane of worm was tortuous and broken, rhoptry was swollen and broken, dense granules was decreased or disappeared, and mitochondrial was enlarged (TEM ×10000)
C: In the pyrimethine controlled group, the worm membrane was tortuous, mitochondrion was obviously enlarged, endoplasic reticulum was broken, dense granules was decreased, and nucleus was contracted (TEM ×8000)
2.2 肝组织及其内弓形虫速殖子超微结构的改变 阳性对照组：肝细胞受弓形虫的损害程度随着虫体感 染时间的延长而明显加重。主要表现为肝细胞肿大，线粒体明显肿胀，嵴边移甚至空泡样变，伴有线粒体的增生，粗面内质网肿胀破裂，核膜迂曲，核仁边移，染色质聚集成块(图2A)，同时伴有少量白细胞浸润。肝组织内弓形虫形态结构与正常虫体结构一致。扁桃酸治疗组：肝细胞在感染后24、72h与正常肝细胞超微结构基本相同。在小鼠死亡后肝细胞受损程度较重，电镜下肝细胞核形不规则，核膜迂曲，染色质凝集成块、边移，线粒体肿胀，匀质改变，细胞器模糊不清。肝组织内弓形虫随扁桃酸作用时间的延长，其受损程度明显加重。在治疗早期(24、72h)肝组织内虫体胞膜突出、破裂，胞质中出现空泡，线粒体和内质网肿胀或破裂，致密颗粒消失，虫体电子密度降低(图2B)。乙胺嘧啶对照组：在感染早期，肝细胞大量破坏，染色质凝集，核膜迂曲，细胞器结构不清、匀质改变，线粒体消失，粗面内质网破裂成碎片。随着用药时间的延长，肝细胞受损程度更加严重。肝组织内虫体破坏明显。虫体核膜断裂，核固缩，细胞器结构模糊，可见残留的棒状体(图2C)。
图2 肝组织及其内弓形虫速殖子超微结构的改变(略)
Fig.2 The microstructure change of liver tissues and toxoplasma tachyzoite
A: In the positive controlled group, the liver cell enlarged, mitochondrion was swollen, endplasmic reticulum was swollen and broken, the nucleus membrane was tortuous, nucleoli moved aside, and chromatin was accumulated as block. Toxolasma in live tissue was identical with the normal worms (TEM ×6000)
B: In the mandelic acide treated group, the membrane of liver cell nucleus was tortuous, chromatin was accumulated as block and moved aside, mitochondron was slightly swollen. However, the membrane of toxopalsma in liver tissues was stickled out and broken, vacuole lied in cytoplasma, mitochondrion and endoplasic reticulum were swollen or broken, and dense granules were disappearing (TEM ×10000)
C: In the pyrimethine controlled group, many liver cells were broken, chromatin was accumulated, membrane of nucleus was tortuous, and the structures of cell organs were unclear. The nucleus membrane of toxoplasma was broken, nucleus was contracted, the structure of cell organs was vague, incomplete rhoptry was observed (TEM ×10000)
3 讨论
扁桃酸(mandelic acid)是从蔷薇科植物桃树的叶子中提取的扁桃酰胺的水解产物。其小鼠灌胃的LD50高达3285mg/kg，小鼠静注的LD50为1128.7mg/kg。Ames试验与微核试验证明无致突变性和致过敏性[5]。张敏如等[6]首先将扁桃酸用于抗阴道毛滴虫的实验研究，李哲等[3]首先将扁桃酸用于体外抗弓形虫的实验研究，司开卫等[79]将扁桃酸用于小鼠体内抗弓形虫的研究，均证明扁桃酸有较强活性。本实验应用电镜观察腹水及肝组织中弓形虫超微结构的改变以及弓形虫对肝细胞超微结构的影响，探讨扁桃酸体内抗弓形虫的作用机制。
3.1 细胞膜是维持细胞内环境稳定的基础 虫体的细胞膜受扁桃酸的作用损伤破裂后，虫体细胞赖依生存的理化环境发生改变，从而影响细胞器的功能。
3.2 细胞器中的类锥体、极环、棒状体和致密颗粒与虫体的运动和侵入宿主细胞均有关系 类锥体是由一组或几组向上旋曲的纤丝组成的中空截圆锥状结构，类似一个压缩的弹簧。类锥体可使虫体出现旋转、延伸及收缩等运动[10]，在虫体主动入侵宿主细胞的过程中起重要的作用。棒状体可释放一个或多个表面活性因子，降低宿主细胞膜的黏性，从而促进虫体入侵。同时棒状体在虫体入侵时分泌多种蛋白质及膜性物质。Sadak等 [11]认为，棒状体蛋白含有侵入促进因子，棒状体分泌物还可能与围虫泡膜(package vacuole membrane, PVM)形成有关。PVM似乎由宿主质膜及棒状体分泌物成分组成，并不与宿主的溶酶体融合。有学者认为PVM由宿主细胞膜和虫体细胞膜组成，其结构中包含来自宿主细胞和虫体的蛋白。PVM可阻止宿主溶酶体对围虫泡的融合，有利于虫体在宿主细胞内的生存，而扁桃酸破坏虫体的棒状体，可使PVM形成障碍，有利于宿主溶酶体与围虫泡的融合而杀灭虫体。在虫体入侵细胞后，速殖子通过细胞排粒作用将致密颗粒内容物排入围虫泡内。致密颗粒的分泌物主要有4种蛋白：27ku(GRA1)、28ku(GRA2)、30ku(GRA3)和40ku(GRA4)[12]。这四种蛋白见于围虫泡的网状结构和围虫泡膜上。因此，致密颗粒与围虫泡形成有关。而扁桃酸能使虫体致密颗粒减少，从而使致密颗粒蛋白合成障碍，阻止围虫泡的形成，有利于杀灭虫体。细胞器中的线粒体和内质网是虫体进行能量代谢和物质代谢的主要场所。扁桃酸使虫体的线粒体和内质网均受到明显破坏，从而破坏了虫体能量和物质的代谢。这必将引起虫体生理代谢活动发生障碍，导致虫体死亡。
3.3 细胞核是细胞遗传信息储存、复制和表达的重要结构 核膜的完整能使细胞核在细胞质中有一个相对独立的系统。染色质是生物的遗传物质，因此细胞核在细胞繁殖、维持自身稳定性上起重要作用[13]。而扁桃酸能使虫体核膜破裂，染色质聚集成块，从而破坏了虫体繁殖的生命信息，导致虫体繁殖受到明显抑制并死亡。
综上所述，扁桃酸对虫体细胞膜、细胞质中的细胞器和细胞核的破坏作用使虫体赖以生存的理化环境和物质的能量代谢受损。扁桃酸可以阻止虫体主动入侵宿主细胞，阻碍围虫泡膜的形成，有利于宿主细胞杀灭虫体，同时破坏遗传信息，抑制虫体的繁殖。此结果与李哲等[14]报道的情况基本一致。另外，与乙胺嘧啶进行比较，发现扁桃酸对肝细胞的影响程度明显轻于乙胺嘧啶的作用。乙胺嘧啶在杀灭弓形虫的同时，也破坏了肝细胞。因此扁桃酸是疗效确切、毒副作用较低的抗弓形虫药物。
参考文献：
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(编辑 韩维栋)
基金项目：国家自然科学基金(No.30571628); 陕西省科技攻关基金(No.2004K10G62)
(西安交通大学医学院免疫学与病原生物学系，陕西西安 710061)
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