白藜芦醇治疗大鼠急性胰腺炎肺损伤的实验研究
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摘要：目的 探讨急性胰腺炎(AP)大鼠肺损伤与肺组织选择素(选择素P、选择素E )表达的关系及白藜芦醇对肺损伤的作用。方法 96只雄性大鼠分为对照组、模型组、治疗组、溶剂组。用40g/L牛黄胆酸钠逆行胆胰管注射建立胰腺炎模型，治疗组在建模后立刻经阴茎静脉注射溶解于吐温80溶剂中的白藜芦醇(10mg/kg)。术后3、6、12h取材，盲法光镜下观察大鼠肺组织病理学改变，同时检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中的白细胞数及肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性，免疫组化法检测肺脏毛细血管内皮选择素P、选择素E表达。结果 治疗组肺组织损害明显较模型组肺组织轻(P<0.05)；随时间推移模型组BALF中白细胞数及肺组织MPO活力逐渐增高，而治疗组BALF中白细胞数及肺组织MPO活力在各时间段均较模型组降低(P<0.05)；选择素P、E在模型组呈强阳性表达，治疗组表达较弱。结论 在胰腺炎肺损伤中白藜芦醇可能通过降低肺脏毛细血管内皮选择素表达,使白细胞与内皮细胞黏附减少，炎性细胞局部浸润降低，而达到治疗胰腺炎肺损伤的目的。
关键词：白藜芦醇；胰腺炎；肺损伤;选择素；大鼠
The experimental study of resveratrol in the acute pancreatitis combined with lung injury in rats
Ren Lei, Ma Qingyong, Wang Zheng, Li Zhendong
(Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)
ABSTRACT: Objective To explore the relationship of acute lung injury(ALI) in experimental pancreatitis to selectin P and selectin E and to study the effects of resveratrol on ALI. Methods A total of 96 male SD rats were divided into 4 groups radomly with 24 rats in each group: control group, pancreatitis group (model), resveratroltreated group and tween80treated group (solvent). The model of acute pancreatitis was performed by injecting 4% sodium taurocholate into the biliopancreatic duct. Resveratrol was given through penis vein after modeling. Tween80 was used as a solvent of resveratrol. The rats were killed at 3,6,12 hours after modeling. The degree of ALI was judged by studying the pulmonary morphologic changes, leucocytes of bronchi alveolar lung fluid (BALF) and myeloperoxidase (MPO) in lung tissue. The selectin P and selectin E in vascular endothelium of lung tissue was detected immunohistologically. Results Severe pulmonary morphologic changes were observed in pancreatitis group. The counts of leucocytes in BALF and the amount of MPO were increased with time passing. There was a less degree of ALI in resveratroltreated rats than in pancreatitis rats. Resveratrol reduced the counts of leucocytes in BALF and the amount of MPO(P<0.05). Selectin P and selectin E are expressed more positive in pancreatitis group than in treatment group(P<0.05). Conclusion The effect of reduced severity of ALI during acute pancreatitis by resveratrol might be related to the inhibition of the selectin expression and reduction of the adhension between inflammatory cells and endothelium cells.
KEY WORDS: resveratrol; pancreatitis ; lung injury ; selectin; rats
急性胰腺炎是一种既有胰腺本身病变，又极易并发远隔脏器损害的急腹症，至今仍有较高的病死率。其中急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是急性胰腺炎早期常见的并发症和死亡原因，其死亡率高达50%[1] 。急性胰腺炎常引起急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS),虽其机制仍不十分清楚,但业已证明ARDS时白细胞在肺脏的浸润激活,通过释放细胞因子、活性氧参与了急性肺损伤的病理生理过程。本实验通过大鼠急性胰腺炎模型，探讨白藜芦醇注射液治疗急性胰腺炎大鼠后对胰腺炎肺损伤及肺组织血管内皮细胞黏附分子表达的影响，探讨其对重症急性胰腺炎肺损伤的治疗及作用机制，为白藜芦醇用于临床治疗急性胰腺炎提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料 健康雄性SD大鼠96只，购自西安交通大学医学院实验动物中心，体重250-300g；牛黄胆酸钠由Sigma公司提供；白藜芦醇注射液由西安交通大学药学系提供；SABC免疫组化试剂盒、选择素P、E和单克隆抗体购自武汉博士德公司。
1.2 动物分组 将SD大鼠随机分为4组：对照组、模型组、白藜芦醇治疗组和溶剂组。每组又分为术后3、6、12h组，每组8只。
1.3 制备动物模型 大鼠术前禁食12h，不禁水。用25g/L戊巴比妥钠腹腔注射(0.1mL/100g)麻醉，正中切口入腹，上提胃十二指肠，显露胰腺，确认胆胰管，并在胆胰管十二指肠入口端以及胆总管远端分别用血管夹暂时钳夹。逆行向胆胰管注射40g/L牛黄胆酸钠，剂量为0.1mL/100g，注射完毕停留2min后松开血管夹，关腹。白藜芦醇治疗组在制模后立即经阴茎静脉注入溶解于吐温80中的白藜芦醇注射液10mg/kg，溶剂组在阴茎静脉注入与治疗组等量的吐温80，以排除溶剂对实验的影响，对照组用等量生理盐水建模。
1.4 留取标本 将各组大鼠分3批剖杀(制模后3、6、12h)，每批各8只。处死前开腹，观察胰腺、胰周等腹内病变;穿刺下腔静脉取血，开胸后观察肺脏，切取右侧肺脏做支气管肺泡灌洗，灌洗液收集后待测白细胞计数，并留取胰腺、左肺上叶标本，分别以Bouin液固定，供组织学检查及免疫组化切片。左肺下叶标本用于肺组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)检测。
1.5 形态学检查及肺组织评分 常规石蜡切片，HE染色，确定胰腺炎诊断，按肺水肿、出血、炎性细胞浸润、小气道损伤进行评分，每项5个等级：0、1、2、3、4。
1.6 支气管肺泡灌洗的收集及白细胞计数 开胸后观察肺脏，切取右侧肺脏，由主支气管插入直径2mm无菌塑料导管并固定，恒压注入无菌生理盐水3mL，共3次，收集灌洗液，用于白细胞计数。
1.7 肺组织MPO活性检测 取肺组织约100mg，加5g/L HTAB 2mL制备匀浆，反复冻融3次并超声粉碎(10s，3次)，4℃ 3000r/min离心30min，取上清0.1mL加反应液2.9mL，保持温度于25℃，立即在分光光度计460nm波长下进行2min的扫描，记录第30s和第90s的吸光度差值，以此1min内吸光度的变化代表酶活力的改变，MPO活力单位(U/g)= (ΔA460/min)/11.3×(g所加组织量/L反应液)。
1.8 肺脏组织选择素P、E的测定 取大鼠左上肺组织，大小约2.5cm×1.5cm×0.5cm，Bouin液固定，石蜡切片，严格按照试剂盒说明步骤进行操作，免疫组化结果用图像分析系统进行处理。
1.9 统计学处理 数据以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析，SPSS统计软件进行分析，P<0.05表示有显著性差异。
2 结果
2.1 肺组织形态学变化 HE染色后，显微镜下观察，模型组胰腺组织水肿明显，大量中性粒细胞浸润伴间质出血，可见细胞核溶解改变。观察肺组织，模型组水肿明显，间质与肺泡腔有红细胞，间质中见中性粒细胞、巨噬细胞侵润，尚可见细胞核固缩碎解,而在治疗组中，这些现象得到明显的改善。采用肺组织评分方法， 6h各组病理学变化如表1。
表1 肺组织的形态学评分(略)
Table 1 The morphology score of lung
*P<0.05 vs. treatment group
2.2 大鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞计数结果及MPO的测定结果 急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)模型制备后，支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中白细胞计数呈递增趋势，显著高于对照组(P<0.05)。白藜芦醇治疗组BALF中白细胞计数较模型组及溶剂组下降,差异显著(P<0.05)，但模型组与治疗组在术后3h无统计学意义。同时，AP术后肺组织中MPO活性随时间延长递增，模型组较对照组显著增加；治疗组中MP较模型组及溶剂组显著降低(P<0.05，表2)。
2.3 选择素P、E灰度测定结果 随时间的延长，模型组肺组织选择素表达增强，选择素E在术后6h达峰，选择素P在术后3h表达最强，术后6、12h消失。治疗组表达弱,两组具有显著性差异(P<0.05)，而模型组与溶剂治疗组两组之间无统计学差异。
表2 支气管肺泡灌洗液中白细胞的计数及肺组织MPO的测定(略)
Table 2 The amount of white blood cell in BALF and MPO in lung tissue
*P<0.05 vs. control group; # P<0.05 vs. AP group
表3 肺组织表达的选择素通过图像分析所得到灰度值的测定结果(略)
Table 3 The result of selectin in lung tissue by image analysis
# P<0.05 vs. model group; *P<0.05 vs. control group; △: 3h
3 讨论
近年来的研究发现，AP引发的ARDS及多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)等并发症是其主要死亡原因。MODS最先累及的器官经常是肺。ALI与多种细胞因子及其他炎性介质的作用有关[12]。肺组织中中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils, PMN)的浸润在ALI的发病过程中起着关键性作用[3] 。PMN的聚集与内皮细胞的黏附以及炎症介质的释放都需要多种黏附分子的参与[4]。选择素家族是黏附分子中的一种。它们主要介导白细胞与内皮细胞之间的黏附。
PMN与内皮细胞黏附，进而穿越血管内皮屏障是实现PMN在肺内大量“聚集”的关键，是PMN发挥对肺脏损伤作用的前提。PMN穿越血管内皮首先必须沿内皮滚动,这是实现PMN穿越血管内皮的第一步，而选择素P、E就作用于这个环节。它们在促进白细胞与内皮细胞黏附中具有关键作用 [56]。PMN造成ALI机制有三个方面 ：①活化的PMN黏附并且穿过肺血管的内皮细胞后开始脱颗粒，并进一步释放髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)、弹性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)、乳铁蛋白、氧自由基等破坏肺的超微结构；酶类物质在肺组织中进行蛋白分解作用，使肺毛细血管的通透性增加,导致间质水肿和细胞液外渗，进而影响肺的通气功能和机械功能[7]。②激活的PMN可释放过多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)。ROS一方面通过氧化细胞膜脂质直接损伤肺实质细胞，另一方面还可损伤毛细血管基底膜等肺间质成分,造成肺水肿[8]。③活化的PMN还可激活磷脂酶A2，产生许多血管活性物质,如白细胞三烯和血小板活化因子。这些物质使肺血管收缩，通透性增加,并进一步促进PMN对血管壁的黏附。活化的PMN分泌多种细胞因子，如TNFα、IL6等。这些细胞因子形成炎症介质网络,产生放大和级联效应，造成多器官损伤。
相关研究表明，白藜芦醇具有抗休克、改善微循环、对内毒素性器官损伤的保护作用、抗氧化、抗肿瘤等多种作用[910]。我们通过建立急性胰腺炎大鼠模型，对不同组之间大鼠肺组织形态学、支气管肺泡灌洗液的收集及白细胞计数、肺组织MPO检测、肺脏组织选择素P、E的测定等可见，白藜芦醇对急性胰腺炎肺损伤具有一定的治疗作用。其作用机制可能为：在细胞水平表现为减少中性粒细胞在肺脏的浸润、聚集；在分子水平表现在下调黏附分子，使选择素表达降低，从而减弱其对中性粒细胞的趋化聚集，减少细胞因子的释放和酶类物质的释放，以减轻损伤；减少中性粒细胞与肺组织毛细血管内皮黏附，改善局部微循环，防止通气血流比值失调。此外，白藜芦醇本身具有多种生物活性，能够抑制炎症因子的释放。因此，白藜芦醇是一种有效的治疗胰腺炎的药物，具有较好的临床应用价值。
参考文献：
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(编辑 韩维栋)
(西安交通大学医学院第一附属医院肝胆外科，陕西西安 710061)
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