Ｓｕｒｖｉｖｉｎ在涎腺良性、交界性、恶性多形性腺瘤中的表达及意义
 |
| 第1页 |
参见附件(305KB，4页)。
摘要：目的 探讨Survivin在涎腺良性多形性腺瘤(PA)、交界性多形性腺瘤(RPA)、恶性多形性腺瘤(MPA)中的表达及其与肿瘤增殖活性的相关性。方法 应用免疫组织化学方法及原位杂交技术检测14例涎腺PA、9例RPA、11例MPA以及9例癌旁腺组织中Survivin的表达。结果 Survivin mRNA在涎腺PA、RPA、MPA中的表达与其蛋白表达相比均无显著性差异，而在癌旁腺体中的表达存在显著性差异(P<0.05)；在涎腺PA中Survivin mRNA及其蛋白的表达均明显低于RPA、MPA及癌旁组织(P<0.01)，而RPA与MPA中的表达无显著性差异；在MPA中高分化者与中低分化者的表达均有显著性差异(P<0.05)。结论 Survivin基因的转录和扩增可能参与多形性腺瘤的发生、发展及恶变进程,并且在肿瘤发生的不同阶段有不同表达，有望成为涎腺肿瘤诊断和治疗的新靶点。
关键词：Survivin；多形性腺瘤；免疫组织化学；原位杂交
The expression of survivin gene in malignant pleomorphic adenoma, relay pleomorphic adenoma and pleomorphic adenoma
Qi Hong, Wang Kangmin, Yang Lilin
(Department of Pathology, Stomatologic Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University,Xian 710004; Department of Pathology, the Second Affiliated Hospital,
Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)ABSTRACT: Objective To study the expression of survivin in malignant pleomorphic adenoma, relay pleomorphic adenoma and pleomorphic adenoma. Methods The transcription and interpretation of urvivin mRNA in the salivary gland tumor were analyzed via immunohistochemistry and in situ hybridization methods. Results Survivin mRNA expression and protein expression were almost the same in malignant pleomorphic adenoma, relay pleomorphic adenoma and pleomorphic adenoma. But they were different in the gland around the malignant pleomorphic adenoma. There was a significant difference of Survivin mRNA and protein expression in pleomorphic adenoma and malignant pleomorphic adenoma, and relay pleomorphic adenoma. The expressions were almost the same in relay and malignant pleomorphic adenoma. Conclusion The expression of survivin mRNA and protein is increased in pleomorphic adenoma and may be involved in the onset and progression of pleomorphic adenoma. It indicates that mRNA is relatively stable in the mRNA transcription and protein interpretation in malignant pleomorphic adenoma, and it is also showed earlier in gene amplification than in protein expression of the malignant tumor in the initial stage of malignant pleomorphic adenoma. Survivin can be a new diagnostic/therapeutic target in pleomorphic adenoma.
KEY WORDS: survivin; pleomorphic adenoma; immunohistochemistry; in situ hybridization
肿瘤的发生尽管存在基因改变的复杂性和多因素性，但细胞增殖和细胞凋亡调控失常是普遍存在的因素。多形性腺瘤(pleomorphic adenoma, PA)是涎腺最常见的肿瘤，被认为属交界性肿瘤，其与恶性多形性腺瘤(malignant PA, MPA)都被发现存在有许多与凋亡和增殖有关的基因，如cmyc，p53，bcl2等的异常表达或基因突变。Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成员，能直接抑制Caspase3和Caspase7活性，阻止细胞凋亡[1]。随着研究不断深入，发现其也能影响细胞周期循环，被认为是维持细胞增殖与凋亡平衡的界面分子。在本研究中我们探讨了Suvivin在涎腺PA、RPA、MPA中的表达情况，以期为良恶性多形性腺瘤的诊断及治疗提供依据。
1 材料与方法
1.1 标本来源 选取我院近年手术切除的涎腺良性PA、交界性多形性腺瘤(relay PA, RPA)、恶性多形性腺瘤(malignant PA, MPA)标本及MPA所带瘤旁组织。其中MPA 11例，男9例，女2例，平均年龄56.5岁。PA与RPA共23例，男13例，女10例，平均年龄46.45岁。阳性对照胚胎腺组织为6-7周流产胎儿颌下腺组织。标本均经40g/L甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续4μm切片。
1.2 主要试剂 鼠抗人Survivin单克隆抗体为美国Santa Crus公司产品；免疫组织化学PV6000试剂盒及DAB显色试剂盒为Zymed公司产品，均购自北京中山公司；Survivin原位杂交试剂盒购自武汉博士德公司。
1.3 方法
1.3.1 免疫组化染色 Survivin工作浓度1∶80，染色前行微波抗原修复， DAB显色，苏木素轻度复染。磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。
1.3.2 原位杂交 杂交前各步严防RNA酶污染，所有实验用品均用DEPC处理。以预杂交液代替杂交液作为空白对照，同时进行芯片的管家基因——GAPDH基因检测，作为内参照，以剔除基因损失而造成的假阴性。
1.3.3 结果判断 Survivin染色以胞浆中染成棕黄色为阳性，少数出现胞核阳性。凡染色强度明显高于背景者为阳性表达。将阳性细胞按其数量及染色强度分为3级:弱阳性(+)，即阳性细胞数小于10%，染色强度为弱阳性或仅个别细胞呈中至强阳性；强阳性()，即阳性细胞数为60%以上，染色强度为中至强阳性，少数细胞可为弱阳性表达；中度阳性 ()，即阳性细胞数介于表达弱阳性与表达强阳性两级之间；染色强度与背景无明显差别者为阴性。
1.4 统计学处理 构成比资料采用χ2检验，单向有序列联表资料采用秩和检验，以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 涎腺PA、RPA、MPA及癌旁腺体中Survivin mRNA的表达 胚胎腺组织中腺泡、导管均见表达(图1a)；正常腺组织腺泡中均无Survivin表达，而闰管及纹管均弱阳性表达(图1b)；PA主要表达于鳞状化生区；RPA主要表达于肿瘤性上皮细胞，包括导管结构内层的腺管上皮细胞和外层的肌上皮细胞、肌上皮团块及鳞状化生区域的细胞浆中，而在黏液软骨样区几乎不表达(图1e)；MPA主要表达于其恶性组分中(图1d)；MPA瘤旁腺体中腺泡、导管均见表达(图1c)。
在涎腺PA中Survivin mRNA表达明显低于RPA 、MPA及癌旁组织中的表达(P<0.01)，而RPA与MPA中的表达无显著性差异(P>0.05)；在高分化与中低分化MPA中的表达具有显著性差异(P<0.05，表1)。
表1 涎腺PA、RPA、MPA及癌旁组织中Survivin mRNA表达(略)
Table 1 Expression of Survivin mRNA in PA, RPA, MPA, and the gland around MPA
PA: pleomorphic adenoma; MPA: malignant pleomorphic adenoma; RPA: relay pleomorphic adenoma
*P<0.01 vs. RPA, MPA, and the gland around MPA; ▲P<0.05 vs. RPA; △P<0.05 vs. highgrade MPA
2.2 涎腺PA、RPA、MPA及癌旁腺体中Survivin蛋白表达 其表达情况与mRNA表达相一致(图1f1k)。在涎腺PA中Survivin蛋白阳性表达率均明显低于RPA、MPA及癌旁组织中的表达(P<0.01)，而RPA与MPA间无显著性差异(P>0.05);癌旁腺体与MPA表达有显著差异(P<0.01，表2)。
表2 涎腺PA、RPA、MPA及癌旁腺体中Survivin蛋白的表达(略)
Table 2 Expression of Survivin protein in PA, RPA, MPA, and the gland around MPA
*P<0.01 vs. RPA, MPA, the gland around MPA; △P<0.05 vs. the gland around MPA
2.3 涎腺PA、RPA、MPA及癌旁腺体中Survivin mRNA表达与蛋白表达的相关性 Survivin mRNA表达在涎腺PA、RPA、MPA中与其蛋白表达无显著性差异(P>0.05), 而在癌旁腺体中表达有显著性差异(P<0.05，表3)；配对设计资料进行检测，二者符合率为91.17%。两种方法检测结果有相关性(P<0.05，表4)。
图1 Survivin mRNA及其蛋白在涎腺PA、RPA、MPA及癌旁组织中的表达(略)
Fig.1 The expression of Survivin mRNA and protein in the salivary gland, and RPA, and MPA, and the gland around MPA
a: Embryonic parotid gland; b: Normal salivary gland; c: The gland around the malignant tumor; d: Malignant pleomorphic adenoma; e: Relay pleomorphic adenoma(in situ hybridization); f: Embryonic parotid gland; g: Normal salivary gland; h: The gland around the malignant tumor; i: Malignant pleomorphic adenoma; j: Relay pleomorphic adenoma (immunohistochemistry)
表3 涎腺PA、RPA、MPA及癌旁腺体中Survivin mRNA与蛋白表达的关系(略)
Table 3 The raletion between expression of Survivin mRNA and its protein in PA, RPA, MPA, the gland around MPA
表4 Survivin mRNA表达和蛋白表达的相关性分析(略)
Table 4 The correlation between the expression of Survivin mRNA and its protein
3 讨论
细胞增殖和凋亡平衡对于维持细胞内稳态及组织形态是至关重要的，平衡的破坏将为存在基因缺陷的细胞提供生存优势，促使基因突变和细胞的瘤变或恶性转化，最终导致肿瘤发生和进展[2]。Survivin是近来分离的哺乳动物IAP的新成员，与其他IAP家族成员不同的是，Survivin在组织分布上具有明显细胞选择性。以往研究表明，成人组织中Survivin mRNA除了在胎盘和胸腺中微弱表达外，在其他组织中均未检测到，而在几乎所有被研究的肿瘤中表达[4]。有研究表明，Survivin在癌前期病变组织和肿瘤组织中特异性高表达，其阳性率在不同肿瘤中差别极大，并且这种表达与瘤组织凋亡指数的减少显著相关[3]。
关于涎腺多形性腺瘤的性质争论较多。由于其特殊的生物学行为，在手术治疗中常需摘除涎腺组织。有人认为存在包膜浸润及复发病例的多形性腺瘤可认为低度恶性，然而，目前为止尚无定论。本实验将有包膜浸润、局部细胞生长活跃及复发病例根据其特点归为RPA，其Survivin mRNA阳性表达率为77.78%。
本研究结果表明， RPA与MPA 中SurvivinmRNA表达无显著性差异(P>0.05)，而与PA有显著性差异(P<0.05)，说明包膜浸润、局部细胞生长活跃及复发PA在基因表达上高于涎腺PA，而与MPA无差异；同时，癌旁腺体与MPA中表达亦无显著差异，表明Survivin在PA恶变过程的早期阶段即表达上调，提示Survivin的高表达是涎腺肿瘤恶变的早期事件。Survivin基因的转录与涎腺PA的发生无关，而与MPA的恶性发展有关，Survivin转录异常可能出现于PA恶性转化的早期。这在前恶性损伤性病变如胰腺导管内乳头状黏液瘤中已得到证实[5]。Satoh等[5]在26例胰腺导管腺癌研究中发现， Survivin基因阳性表达20 例(76.9%) ，16例胰腺导管内乳头状黏液瘤(交界性)Survivin阳性表达9例(56.3%)，指出Survivin 在前恶性损害中也出现阳性表达。本研究在涎腺RPA与MPA中Survivin mRNA阳性表达无显著性差异(P>0.05)，说明交界性PA具有恶变潜能，Survivin mRNA在涎腺RPA的恶变中起着一定作用。这与Satoh等结果一致，表明Survivin基因在涎腺肿瘤恶性改变的早期就发挥着重要作用，可作为涎腺恶性肿瘤早期诊断的新的标志物。
另外，本研究发现Survivin在MPA中的表达与其分化程度具有显著相关性(P<0.05)，表明其表达与MPA的分化有关。这与Noriyuki等[7]在子宫内膜癌的研究及Adida等[6]在大B细胞淋巴瘤的研究中均得出Survivin表达与肿瘤的分化程度有关的结论相一致。
同时，本研究得出Survivin蛋白表达与原位杂交基本一致，两种方法结果显示具有一致性(P<0.05)。需要提出的是，在免疫组化研究中癌旁腺体与良性、交界性、恶性肿瘤的Survivin蛋白表达均有显著性差异(P<0.05)。这一点与原位杂交结果不同，提示癌旁腺体中Survivin基因在蛋白翻译水平上介于良性与交界性和恶性肿瘤之间，也具有恶化的倾向。
本研究发现Survivin在PA、RPA、MPA中原位杂交与免疫组化表达率符合率为91.17%，表明Survivin基因在该肿瘤中mRNA和蛋白表达水平上具有较高的一致性(P>0.05)，该基因在mRNA和蛋白水平是相对稳定的。本研究中1例MPA免疫组化法检测阳性而原位杂交法检测阴性，1例RPA、1例MPA中原位杂交法检测阳性而免疫组化法检测阴性，可能是两个表达水平上的调控机制不平衡所致，推测某些细胞没有对mRNA进行有效翻译，或者翻译过程中存在蛋白表达丢失的可能。关于Survivin mRNA表达与蛋白表达的关系，本文显示二者呈显著相关性，但并不完全吻合，说明基因的转录并不总是能同时导致蛋白产物的表达，而且蛋白产物的过度表达也不一定同时与mRNA表达一致，推测该过程可能存在其他未知的基因参与了该基因的转录、翻译的调控。
在MPA癌旁腺体中原位杂交表达率为55.56%，免疫组化表达率为33.33%，二者符合率为66.67%。其中3例ISH阳性而IHC阴性，无IHC阳性而ISH阴性者。在统计学上有显著性差异，推测Survivin基因在恶性肿瘤发生初期的转录及翻译过程可能存在一定时间的延迟性。
本研究结果表明，Survivin与涎腺MPA的发生、发展有关。在已形成的MPA中该基因在转录和翻译水平是相对稳定的，表明Survivin基因在MPA中存在稳定表达，异常表达的Survivin可能通过抑制恶性细胞凋亡参与MPA的发展。而在MPA旁腺组织检测到了Survivin的表达，提示了Survivin的转录可能出现于恶性转化的早期。机体内Survivin启动子被激活，该基因出现转录和翻译水平的异常，使细胞凋亡受到抑制，肿瘤得以异常增殖，导致MPA的发生。在这一阶段其蛋白和mRNA表达的不一致表明该阶段基因转录与翻译可能存在一定时段的延迟。目前导致Survivin基因在肿瘤中的活化的因素仍然不清楚，转录因子之间的相互作用是否导致Survivin的活化仍待研究。
综上所述，Survivin在恶性多形性腺瘤中存在异常表达，且其表达与细胞的分化增殖有关。Survivin可能通过干扰肿瘤细胞凋亡和增殖平衡，促进恶性多形性腺瘤的发生和发展。针对Survivin的基因治疗可能有良好的应用前景。
参考文献：
[1]Shin S, Sung BJ, Cho YS. An anti apoptotic protein human surviving is a direct inhibitor of caspase 3 and 7 [J]. Biochemistry, 2001,40(4):11171123.
[2]Evan GI, Vousden KH. Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer [J]. Nature, 2001,411(6835):342348.
[3]Ito T, Shiraki K, Sugimoto K, et al. Survivin promotes cell proliferation in human hepatocellular carcinoma [J]. Hepatology, 2000, 31(5):10801085.
[4]Grossman D, M cN iff JM, Li F, et al. Expression of the apoptosis inhibitor, survivin, in nonmelanoma skin cancer and gene targeting in a keratinocyte cell line [J]. Lab Invest, 1999, 79(9):11211126.
[5]Satoh K, Kaneko K, Hirota M, et al. Expression of survivin is correlated with cancer cell apoptosis and is involved in the development of human pancreatic duct cell tumors [J]. Cancer, 2001, 92(2):271278.
[6]Adida C, Haioun C, Gaulard P, et al. Prognostic significance of survivin expression in diffuse large Bcell lymphomas [J]. Blood, 2000, 96:19211925.
[7]Noriyuki Takai, Tami Miyazaki, Masakazu Nishida, et al. Survivin expression correlates with clinical stage, histological grade, invasive behavior and survival rate in endometrial carcinoma [J]. Cancer Letters, 2002,184:105116.
(编辑 卓选鹏)
基金项目：西安交通大学口腔医院青年基金
(西安交通大学医学院：口腔医院病理科，陕西西安 710004；第二附属医院病理科，陕西西安 710004)
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(305KB，4页)。