Colo205来源大肠癌始动细胞分转移相关基因的表达分析(2)

http://www.100md.com 2014年11月1日 岳昌武 周昕 吕玉红 曾庆良 李园园 王苗 邵美云

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    参见附件。

     1.2.3 RNA-seq及生物学信息学分析

    用TRIzol?总RNA提取试剂盒提取5g以上的总RNA(OD260/OD280≈1.9～2.0)，利用Dynabeads? mRNA试剂盒利用磁珠法分离纯化mRNA后样品委托上海美吉生物技术公司进行高通量测序文库的构建及数据处理。CD133+组/Colo205组/CD133-等3组样品间两两样品的转录本的表达量变化差异显著，以P<0.05和q<0.05和表达变化差异为-2和2倍为差异表达基因筛选标准。

    1.2.4 差异基因定量PCR验证 为了进一步验证表达谱测序获得基因表达变化数据的可靠性，我们随机选取了p53和BCL11A基因，并以?-actin基因作为内参，进行表达变化的定量PCR验证。P53F，5-′ CCCTCCTCAGCATCTTATCCG-3′; P53R， 5-′CAACCT CAGGCGGCTCATAG-3′;BCL11AF 5-′GACAGGGTGCTGCGGT TGA -3′，BCL11AR 5-′ GGCTTGCTACCTGGCTGGAA -3′;?-actin 引物：?-actin F 5-′ TGGCACCCAGCCAATGAA-3′， ?-actin R 5-′ CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。定量PCR反应条件为：95℃ 预变性2mim，40个热循环扩增(95℃变性 10s ， 60℃ 退火扩增 20s)，获得Ct值，以2-△△Ct法进行表达变化分析。

    2 ......

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