新生SD大鼠心肌细胞培养方法的简化与改进(2)
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3 讨论
离体心肌细胞对于心血管生理、药理、代谢、分子生物学等方面的研究具有重要作用，然而心肌细胞增殖能力低，只有刚出生不久的乳鼠心肌细胞原代培养可得到大量高纯心肌细胞[3]。心肌细胞的分离主要有组织贴块法和酶消化法，酶消化法获得的细胞纯度较高，便于生物学观测和实验，应用更加广泛，但是对心肌细胞损伤大，导致获得的细胞活力不高[4]。
本研究对如何提高心肌细胞纯度、减少消化损伤进行了多次探索，总结经验如下：
(1)差速贴壁分离联合Brdu抑制法去除非心肌细胞。差速贴壁法操作简便、用时短、对细胞影响小，但不适于长期培养。加入Brdu培养48h可抑制成纤维细胞，对心肌细胞无毒性与抑制作用，可用于培养时间较长的实验。
(2)使用小牛血清而不用胎牛血清。血清的成分可影响细胞的存活时间和生长状态，胎牛血清含有大量有丝分裂因子，Brdu难以抑制成纤维细胞的生长，培养效果不如小牛血清。
(3)采用低浓度胰酶与I型胶原酶消化心肌细胞。文献中胰酶用量0.05%～0.25%不等，本研究发现高浓度胰酶会损伤心肌细胞间质，细胞死亡率增加，胰酶浓度过低，细胞聚集成团，得不到单个细胞。本实验采用0.8g/L I型胶原酶和0.05%胰蛋白酶消化心肌细胞，对心肌细胞损害小，且消化效率高。
(4)消化时间与次数。采取短时多次的方式加入消化酶，每次不超过8min，以减少对心肌细胞的损伤。
(5)30d后存活率明显降低。心肌细胞需在工作条件下才能保持活力，无负荷状态长期培养，会导致肌丝、线粒体减少，细胞萎缩[5]，因此培养的心肌细胞应在一定时间内使用。
总之，本实验应用改良并简化的心肌细胞培养方法可得到纯度和存活率较高的原代乳鼠心肌细胞，操作方便，重复性好，适合进一步推广。
参考文献
[1] 王瑞华，兰晓莉，曹国祥，等.新生SD大鼠心肌细胞培养方法的简化及改良[J].心脏杂志，2008，02：154-157
[2] 张晓京，张建栋，来丽娜，等.SD乳鼠原代心肌细胞培养方法的改进[J].长治医学院学报，2012，03：171-173
[3] 郭军，鲍翠玉，林国生，等.新生大鼠心肌细胞培养方法的改进[J].心血管康复医学杂志，2006，06：538-540
[4] 王涛，余志斌，谢满江，等.新生大鼠心肌细胞培养技巧[J].第四军医大学学报，2003，02：92
[5] 郝亚荣，李建军，李庚山，等.乳鼠心肌细胞的原代培养[J].心脏杂志，2001，06：473-475
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