张前程，文红梅，刘娜，袁琪，刘睿，崔小兵，李松，陈盛君

    (1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；2.江阴天江药业有限公司，江苏 江阴 214434)

    地龙为常用动物类中药，2015年版《中国药典》收载地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretimaaspergillum(E. Perrier)、通俗环毛蚓Pheretimavulgaris(Chen)、威廉环毛蚓Pheretimaguillelmi(Michaelsen)或栉盲环毛蚓Pheretimapectinifera(Mkhaeken)的干燥体。前一种习称“广地龙”，后三种习称“沪地龙”[1]。地龙具有清热定惊，通络，平喘利尿的功效[2-4]。现代研究表明，地龙还有降压[5]、抗癌[6-9]、抗凝血[10]、抗氧化[11-13]、抗肝纤维化[14]等作用。市场上流通的地龙药材主要为广地龙，广地龙体长、药材加工精细，药理活性显著，临床应用广泛[15]。以其为原料药的中成药有40多个品种，还有广地龙配方颗粒及广地龙汤剂等[16]。广地龙药材与相近物种因形态相似，容易造成品种混杂和掺假现象。广地龙药材的真伪关系着临床用药的有效性和安全性。因此，有必要建立快速准确的特异性物种鉴别方法，以控制广地龙药材的质量。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充[17-18]。在动物药的鉴别中大多采用通用引物COⅠ序列进行PCR扩增测序，如庞中化等[19]通过COⅠ序列对全蝎及其混伪品进行DNA条形码鉴别；贾静等[20]采用COⅠ序列和ITS序列分别鉴别家蚕和白僵菌。但COⅠ序列不能直接作为特异性引物来区分药材品种，必须对所有的样品进行测序再进行聚类分析构建进化树，成本较高，时间较长。通过设计特异性引物，可省去对扩增产物进行测序、构建进化树等复杂的步骤，操作简便快捷，已用于多种动物药品种的基原鉴定。赵玉洋等[21]通过比较麝香及其混伪品的COⅠ序列，设计出一对约180 bp的麝香微型DNA条形码鉴别引物，对麝香及其混伪品进行测序鉴定；刘富艳等[22]通过比较海龙及其混伪品的COⅠ基因序列差异，根据变异位点设计出刁海龙、尖海龙及拟海龙的特异性鉴别引物，鉴别海龙及其混伪品；陈维明等[23]用12SrRNA序列鉴定了广地龙及其近缘品种；田娜等[24]建立了多重位点特异性PCR鉴别方法区分不同地龙品种。本文前期实验中考察了COⅠ、12SrRNA和16SrRNA 3对引物，结果发现COⅠ序列扩增出的条带更为清晰 ......