陈瑞娟，吴坚，田芳，孔祥清，芮庆林

    (1.南京中医药大学附属医院/江苏省中医院,江苏 南京 210029；2.南京医科大学第一附属医院，江苏 南京 210029)

    脓毒症是各种感染导致机体出现反应失调，进而引发多器官功能障碍乃至危及生命的常见急危重症，其发病率和死亡率都高，是现代急诊与重症医学领域的重要研究方向[1]。

    血管内皮细胞是循环血液和血管之间的屏障,参与炎症、凝血、免疫反应、血管张力调节等重要生物过程，血管内皮损伤或功能障碍被认为是脓毒症发生发展的核心环节[2-3]。作为病原体及毒素攻击的主要靶标，内皮细胞被过度刺激后产生大量血管活性物质，可致内皮损伤乃至凋亡，引起器官功能障碍[4-5]。氧化应激与内皮损伤密切相关，疾病状态下活性氧(ROS)含量增加,氧化脂质生成丙二醛(MDA)，后者进一步促进氧化应激导致恶性循环，严重破坏内皮功能。

    参附注射液具有回阳救逆、益气固脱的功效，被广泛应用于脓毒症休克、失血性休克和心肺复苏的临床救治中，疗效确定[6-7]。氧化应激损伤是脓毒症、心脏骤停等多种疾病共存的病理基础[8-9]。既往研究显示参附注射液具有拮抗氧化应激内皮损伤的作用[10]，但具体作用机制尚未完全明确。

    本研究制备血管内皮细胞氧化应激损伤模型，观察参附注射液对血管内皮细胞ECV304氧化应激和凋亡的影响，并探讨可能涉及的信号转导通路，以期明确参附注射液保护血管内皮的作用机制。

    1 材料

    1.1 实验对象

    血管内皮细胞ECV304购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

    1.2 主要试剂

    参附注射液(批号：16110701002)购于华润三九雅安药业有限公司；H2O2、N-乙酰半胱氨酸(NAC)购于国药集团化学试剂有限公司；胎牛血清、1640培养基购于美国Gibco公司；噻唑蓝(MTT)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量检测试剂盒、DCFH-DA荧光探针ROS检测试剂盒购于南京建成生物工程有限公司；异硫氰酸荧光素酯(FITC)标记的Annexin V、碘化丙啶(PI)购于上海碧云天生物技术研究所；Hoechest33258，GAPDH、Cleaved Caspase-3(C-Caspase-3)、Bcl-2和Bax抗体购于美国Sigma公司；ERK和p-ERK单克隆一抗，辣根过氧化物酶标记的二抗购于美国Santa Cruz公司。

    1.3 主要设备

    SW-CJ-1F超净工作台(苏州净化集团安泰公司)；Forma CO2培养箱(美国Thermo Scientific公司)；超声波细胞裂解仪(苏州珀西瓦尔实验设备有限公司)；多功能酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；ZE5流式细胞仪、Trans-Blot Turbo蛋白转印系统、电泳仪(美国Bio-Rad公司)；化学发光及凝胶成像系统(英国Syngene公司) ......