掌琳惠,马元婧,缪蓉,王伟,翁文馨,袁冬平,龙军,孙云霞

    (1.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;2.江苏省中医院老年科,江苏 南京 210004)

    动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是心血管疾病的先发事件,是一种以血管壁脂质沉积为特点的慢性炎症性自身免疫疾病[1]。诱发AS的因素很多,细菌感染机体后释放的LPS可以促进AS的发展。LPS可以促进CD4+T细胞向辅助性T细胞17(Helper T cells 17,Th17)亚群分化,减少调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)亚群的比例。在LPS作用下,机体呈现出抗炎细胞因子(如IL-10、TGF-β等)少、促炎细胞因子(如IL-6、IL-12p70等)多的炎症状态[2-3]。现已知Treg/Th17平衡是调控AS免疫炎症的关键,转录因子Foxp3和RORγt分别是调节Treg和Th17的关键因子[4-5]。

    养阴清热方(YHF)是全国名老中医唐蜀华教授治疗AS的经验方,在临床上已应用多年。课题组前期研究发现YHF可以调节外周Treg/Th17的平衡,改善高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠AS症状[6-7],然而具体机制仍不明确。酪氨酸蛋白激酶/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)通路是多种细胞因子信号转导的共同通路,参与炎症的发生发展。研究表明,IL-6介导的JAK/STAT信号通路在初始CD4+T细胞分化中起重要作用[8],细胞因子IL-6的释放促进了CD4+T细胞分化为Th17和Treg[9]。因此,JAK/STAT通路在Treg/Th17平衡中发挥重要的作用。本实验着重观察YHF对LPS刺激下的小鼠CD4+T细胞Treg/Th17平衡及炎性细胞因子表达的影响,并探讨这一过程是否与JAK/STAT信号通路有关。

    1 材料

    1.1 细胞

    1.2 药品与试剂

    标准品:虎杖苷、白藜芦醇、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷、大黄素、羟基红花黄色素A、姜黄素、芦丁、槲皮素(上海源叶生物科技有限公司,HPLC≥98%,批号:T15A10F85743、R19J12S138196、J17N8Z48440、T17A10F95418、C10J9Q52616、HA0820KA14、Y24F11Y7051、YJ0603HA13)。PBS(武汉博士德生物工程有限公司,批号:09D16B30);RPMI培养基(Hyclone,批号:319075016);胎牛血清(Gibco,批号:1205331);二甲基亚砜(南京化学试剂有限公司,批号:14081511779);LPS(Tocris,批号:1158);小鼠Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells试剂盒(Invitrogen,批号:11416D);MTT(Biosharp,批号:0793);AG490(Sigma,批号:658411);Leukocyte Activation Cocktail(BD Pharmingen,批号:9324126);FITC Rat IgG2a K Isotype对照流式抗体、PE Mouse IgG2a K Isotype对照流式抗体、APC Arm Hamster IgG2a K Isotype对照流式抗体(eBioscience,批号:E00569-1633、4281861、4283465);4×细胞固定破膜缓冲液、5×细胞破膜/洗涤缓冲液(BD Pharmingen,批号:1285830、8229785);抗小鼠CD4 FITC流式抗体(Invitrogen,1984820);抗小鼠CD25 PE流式抗体、抗小鼠IL-17A PE流式抗体(eBioscience,批号:4277529、4306479)、抗小鼠Foxp3 APC流式抗体(BD Pharmingen,批号:5006762);Foxp3兔抗鼠多克隆抗体(Proteintech,批号:01581000);STAT3兔抗鼠多克隆抗体、JAK2兔抗鼠多克隆抗体、RORγt兔抗鼠多克隆抗体、p-STAT3兔抗鼠多克隆抗体、p-JAK2兔抗鼠多克隆抗体(Abcam,批号:GR186186855-6、GR317162-2、GR316144-3、GR287047-19、GR3174887-5);小鼠IL-6、TGF-β、IL-10、IL-12p70 ELISA试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司,批号:EK2061/2、EK2812/2、EK210/3-96、EK212HS-96) ......