张蒙,王新东

    (1.南京中医药大学第三临床医学院,江苏 南京 210028;2.上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203)

    心肌细胞微环境稳态平衡是心脏功能正常的关键因素。冠心病心肌缺血、缺氧状态下发生脂肪酸代谢向糖酵解转变[1],可产生过量乳酸引起细胞外和细胞内pH值显著下降,在急性心肌梗死患者中可降至6.0～6.5[2],导致心肌细胞外酸化,进而形成酸性微环境。细胞外酸化可诱导中性粒细胞活化而促进炎症[3],在炎症相关的心肌损伤中起到重要的作用。因此,阐明缺血缺氧心肌细胞外酸性微环境在心肌炎症中的作用及其潜在的分子机制有助于临床策略的制定和药理学靶点的研究。

    酸敏感离子通道(ASICs)是一类细胞外H+活化的阳离子通道,属上皮钠通道(ENaC)/降解蛋白(DEG)超家族[4]。心肌细胞主要表达ASICs亚基ASIC1a。作为细胞膜上的酸受体,ASICs将细胞外微环境的低pH信号传递到细胞中诱导一系列病理变化[5]。ASIC1a可介导细胞外Ca2+流入,Ca2+作为重要的第二信使,参与下游的炎症等病理过程[6-7]。Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在缺血损伤的心肌细胞死亡反应中起关键作用[8],CaMKⅡδ是心脏中的主要亚型。细胞焦亡是由caspase-1、caspase-4、caspase-5及其效应子gasdermin家族介导的一种的程序性炎症死亡方式。NLRP3炎症小体的激活是细胞焦亡的经典途径。CaMKⅡδ介导的心肌细胞炎症基因表达和炎症小体激活引发炎症并诱导心肌纤维化重塑[9]。目前尚不清楚ASIC1a是否通过CaMKⅡδ-NLRP3信号参与心肌缺血缺氧后的炎症损伤病理过程。

    益气活血是冠心病心肌缺血的经典治法。补气药黄芪和活血药丹参的配伍应用是益气活血法的代表性“药对”,具有抗心肌缺血性重构、调节缺血后能量代谢重编程、抗炎及Ca2+通道调控等效应[10-13]。本研究拟对黄芪丹参配伍调控ASIC1a/CaMKⅡδ信号保护酸性微环境中心肌细胞焦亡的机制进行探讨。

    1 材料和方法

    1.1 细胞

    H9c2大鼠心肌细胞(Procell公司,货号:CL-0089)在专用培养基(Procell公司,货号:CM-0089,主要成分DMEM+10% FBS+1% P/S)中，于37 ℃、5% CO2条件培养。

    1.2 主要试剂

    胎牛血清(Gibco,货号:C0235),Lactate(迈瑞尔,货号:50-21-5),NS383(MCE公司,货号:HY-131879),Nocistatin Peptide(Abbiotec公司,货号:350301),Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(Sigma公司,货号：APOAF),Fluo 3-AM(Dojindo公司,货号:JU887),逆转录试剂盒、荧光定量检测试剂盒(Takara公司,货号:RR036A、RR820A),PVDF膜(Millipore公司),CCK-8试剂盒、Trizol、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL化学发光试剂盒(碧云天公司,货号:C0037、R0016、P0012S、P0018FS),ASIC1a抗体(Ptoteintech公司,货号:27235-1-AP),CaMKⅡδ抗体、NLRP3抗体、Caspase-1抗体、GSDMD抗体和GAPDH抗体(Abcam公司,货号:ab300563、ab181052、ab263899、ab138483、ab219800、ab9485) ......