氯化锂－匹罗卡品诱发大鼠癫痫持续状态后脑内ｃ－ｆｏｓ蛋白表达的动态观察
摘要：目的在氯化锂一匹罗卡品诱发癫痫持续状态模型中观察c-fos蛋白表达的时程变化。方法采用氯化锂一匹罗卡品诱发癫痫持续状态大鼠模型，观察大鼠的行为改变，并用免疫组化方法观察癫痫持续状态后不同时间点脑内c—fos蛋白表达的变化。结果癫痫持续状态后6h，1d时脑内c—fos蛋白表达最高，3d时表达次之，7d时极少数表达并接近对照组表达水平。结论癫痫持续状态后脑内c—fos蛋白表达持续较长时间；在此时期应给予干预措施，以减低脑内神经元损伤可能。
关键词：氯化锂一匹罗卡品；癫痫持续状态；c—fos蛋白
中图分类号：R749.1 R255.2
文献标识码：A
文章编号：1672—1349(2007)05—0419—02
癫痫持续状态(status epilepticus，SE)是指一次癫痫发作持续30rain以上或连续发作多次，发作间歇期意识不恢复者。癫痫持续状态是神经科危急重症之一，癫痫持续状态中脑损害明显的癫痫约占61%～88%，必须从速制止发作，否则危及生命。目前，作为神经元活动的标记物fos蛋白已经广泛用于研究动物神经元对癫痫发作的反应。不同的癫痫模型均可以诱发fos蛋白在大脑神经元中表达。本实验选用氯化锂一匹罗卡品诱发大鼠癫痫持续状态，观察fos蛋白在脑内表达的动态变化。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1实验动物成年健康雄性Wistar大鼠32只(山西医科大学实验动物中心提供)，体重200g～250g。随机分为实验组26只和对照组6只，饲养于正常昼夜环境中，给予标准饲料及饮水。
1.2氯化锂-匹罗卡品癫痫持续状态模型制作 大鼠腹腔注射氯化锂3mEq/kg(中国医药集团上海试剂公司)，18h后再腹腔注射新鲜配制的匹罗卡品30mg/kg(Sigma公司)。对照组大鼠给予生理盐水腹腔注射。给药大鼠在15min～45min出现反复强直一阵挛发作，形成癫痫持续状态。按照经典的Racine癫痫发作行为标准进行癫痫的行为观察记录。0级：无任何反应，正常行为状态；I级：面部阵挛，包括眨眼、动须、节奏性咀嚼等；Ⅱ级：I级加节律性点头；Ⅲ级：Ⅱ级加前肢痉挛；Ⅳ级：Ⅲ级加后肢站立；V级：Ⅳ级加摔倒。实验组动物发作级别均达到Ⅳ级以上。于癫痫持续状态后60 min腹腔注射地西泮(安定，4 mg/kg)以终止癫痫持续状态，降低病死率。实验组按照发作后6h，1d，3d，7d再分为实验1组、2组、3组、4组。
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1.3标本采集与处理实验组大鼠分别在癫痫持续状态发作后6 h，1d，3d，7d及对照组大鼠，用5%水合氯醛按5mL/kg腹腔注射麻醉后，断头取脑。鼠脑组织在4%的多聚甲醛中固定24h，经石蜡包埋后，在海马部位做矢状位切片，片厚约10μm。
1.4 c—fos免疫组化染色常规间接漂染法进行免疫组化染色(试剂选用北京中山生物技术有限公司)。一抗为兔抗c—fos蛋白多克隆抗体，二抗为抗兔IgG辣根过氧化物酶。
1.5图像分析和统计学处理采用Mias(2000型)图像分析系统对海马及海马皮层clos蛋白免疫反应阳性细胞进行定量计数。实验数据采用SPSS11.5软件进行统计学处理。检测结果用均数±标准差(x±s)表示。多样本均数比较采用方差分析，P
3 讨论
氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠模型是近年来国内外麻用较多的一种公认的边缘系统癫痫模型，是Honchar等于1983年首次报道的，该模型使匹罗卡品的用量减少，降低了因匹罗卡品毒副反应所导致的动物死亡率，是目前研究癫痫持续状态和复杂部分性发作对脑部影响最常用的动物模型之一。故本实验选用氯化锂-匹罗卡品诱发颂痫持续状态模型，成功率较高为92.31%，死亡率为7.69%，进一步验证了该模型是研究撕痫持续状态的理想模型而且，氯化锂和匹罗卡品腹腔注射间隔18h～20h，是诱发癫痫的最佳时间，与文献报道相符。
, 百拇医药
c-fos基因作为神经功能活动的代谢性标志物，在癫痫研究中被大量应用。它属于即早基因(inmlediate early genes，lEG)，为细胞受刺激后表达的基因，包括c-fos，c-jun，jun-b，jun—d等。c-fos基因编码的c-fos蛋白是一种核蛋白，c-fos蛋白与Jun家族蛋自形成一个二聚体AP-1(active protein-1，AP-1)，AP-1复合物与细胞基因中的AP-1序列结合而发挥其调节转录的作用。正常情况下，细胞内c-fosmRNA和fos蛋白水平均很低，而在各种化学和电刺激所造成的癫痫活动中，其表达很显著。c-fos和fos的大量表达将干细胞核的修复功能而使细胞走向凋亡。1987年Dragunow和Robertson在研究过程中首次发现，电刺激诱导的癫痫活动能够快速而短哲的使大鼠齿状回颗粒细胞核内的c-fos蛋白免疫反应活性增强。在神经系统中，c-fos蛋白的表达程度与癫痫所致的神经元活动程度有关。而且c-fos蛋白的表达情况也随着发作后时间间隔的变化而变化，Wagner等报道，c-fos在大鼠缺血缺氧96 h可以高表达并且持续较长时间，推断其原因可能为缺血缺氧导致神经元迟发性坏死所致
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本实验成功诱发癫痫持续状态模型，并对c-fos蛋白表达时程作初步研究。结果显示在1h的癫痫持续状态结束后6 h及1d，在大鼠海马及颞叶皮层c-fos蛋白表达显著；大鼠癫痫持续状态后3d，海马结构及皮层c-fos免疫反应阳性细胞明显表达；大鼠癫痫持续状态后7d，海马结构及皮层c-fos免疫反应阳性细胞极少数表达，接近对照组。本研究结果显示癫痫持续状态后如小采取干预措施，脑内神经元损伤将持续较长时间。实验结果与以往研究比较，c-fos蛋白表达显著和表达时间较长，可能与以下因素有关：①所选择的模型不同，以往研究选用的是杏仁核电刺激诱发癫痫；②癫痫持续状态的时间和强度不同，本实验癫痫持续状态大鼠发作均达到Racine 4、5纵发作，持续时间达1h，Kondralyev等研究证实癫痫持续状态超过30min，神经元就会坏化。本实验中c-fos蛋白表达时间延长可能与神经元坏死有关；③所选择的动物不同，本实验选择的大鼠为2月龄雄性大鼠，体重200g～250g，较易诱发癫痫持续状态
fos蛋白或c-fos mRNA的表达作为中枢神经系统功能活动的代谢性标志物，对于研究癫痫持续状态神经元的损伤机制损伤持续时间有重要的意义，可为进行干预措施提供依据。目前，fos蛋白或c-fosmRNA已广泛应用于对癫痫的定位研究，探讨癫痫发生的机制，抗癫药物的筛选和评价，随着分子生物学和免疫化学实验技术的发展，c-fos/fos的表达定量会更加精确，无论单独应用还是与其他方法合用，都有重要的参号价值，将会在癫痫的研究中发挥更大的作用。
作者简介：薛国芳(1976—)，女，在读硕士，现工作于山西医科大学第二医院(邮编：030001)；郑辑英、李光来、王荔，工作于山西医科大学第二医院；刘勇，现为日本国立弘前大学医学部在读博士
(本文编辑 王雅洁), http://www.100md.com
关键词：氯化锂一匹罗卡品；癫痫持续状态；c—fos蛋白
中图分类号：R749.1 R255.2
文献标识码：A
文章编号：1672—1349(2007)05—0419—02
癫痫持续状态(status epilepticus，SE)是指一次癫痫发作持续30rain以上或连续发作多次，发作间歇期意识不恢复者。癫痫持续状态是神经科危急重症之一，癫痫持续状态中脑损害明显的癫痫约占61%～88%，必须从速制止发作，否则危及生命。目前，作为神经元活动的标记物fos蛋白已经广泛用于研究动物神经元对癫痫发作的反应。不同的癫痫模型均可以诱发fos蛋白在大脑神经元中表达。本实验选用氯化锂一匹罗卡品诱发大鼠癫痫持续状态，观察fos蛋白在脑内表达的动态变化。
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1 材料与方法
1.1实验动物成年健康雄性Wistar大鼠32只(山西医科大学实验动物中心提供)，体重200g～250g。随机分为实验组26只和对照组6只，饲养于正常昼夜环境中，给予标准饲料及饮水。
1.2氯化锂-匹罗卡品癫痫持续状态模型制作 大鼠腹腔注射氯化锂3mEq/kg(中国医药集团上海试剂公司)，18h后再腹腔注射新鲜配制的匹罗卡品30mg/kg(Sigma公司)。对照组大鼠给予生理盐水腹腔注射。给药大鼠在15min～45min出现反复强直一阵挛发作，形成癫痫持续状态。按照经典的Racine癫痫发作行为标准进行癫痫的行为观察记录。0级：无任何反应，正常行为状态；I级：面部阵挛，包括眨眼、动须、节奏性咀嚼等；Ⅱ级：I级加节律性点头；Ⅲ级：Ⅱ级加前肢痉挛；Ⅳ级：Ⅲ级加后肢站立；V级：Ⅳ级加摔倒。实验组动物发作级别均达到Ⅳ级以上。于癫痫持续状态后60 min腹腔注射地西泮(安定，4 mg/kg)以终止癫痫持续状态，降低病死率。实验组按照发作后6h，1d，3d，7d再分为实验1组、2组、3组、4组。
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1.3标本采集与处理实验组大鼠分别在癫痫持续状态发作后6 h，1d，3d，7d及对照组大鼠，用5%水合氯醛按5mL/kg腹腔注射麻醉后，断头取脑。鼠脑组织在4%的多聚甲醛中固定24h，经石蜡包埋后，在海马部位做矢状位切片，片厚约10μm。
1.4 c—fos免疫组化染色常规间接漂染法进行免疫组化染色(试剂选用北京中山生物技术有限公司)。一抗为兔抗c—fos蛋白多克隆抗体，二抗为抗兔IgG辣根过氧化物酶。
1.5图像分析和统计学处理采用Mias(2000型)图像分析系统对海马及海马皮层clos蛋白免疫反应阳性细胞进行定量计数。实验数据采用SPSS11.5软件进行统计学处理。检测结果用均数±标准差(x±s)表示。多样本均数比较采用方差分析，P
3 讨论
氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠模型是近年来国内外麻用较多的一种公认的边缘系统癫痫模型，是Honchar等于1983年首次报道的，该模型使匹罗卡品的用量减少，降低了因匹罗卡品毒副反应所导致的动物死亡率，是目前研究癫痫持续状态和复杂部分性发作对脑部影响最常用的动物模型之一。故本实验选用氯化锂-匹罗卡品诱发颂痫持续状态模型，成功率较高为92.31%，死亡率为7.69%，进一步验证了该模型是研究撕痫持续状态的理想模型而且，氯化锂和匹罗卡品腹腔注射间隔18h～20h，是诱发癫痫的最佳时间，与文献报道相符。
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c-fos基因作为神经功能活动的代谢性标志物，在癫痫研究中被大量应用。它属于即早基因(inmlediate early genes，lEG)，为细胞受刺激后表达的基因，包括c-fos，c-jun，jun-b，jun—d等。c-fos基因编码的c-fos蛋白是一种核蛋白，c-fos蛋白与Jun家族蛋自形成一个二聚体AP-1(active protein-1，AP-1)，AP-1复合物与细胞基因中的AP-1序列结合而发挥其调节转录的作用。正常情况下，细胞内c-fosmRNA和fos蛋白水平均很低，而在各种化学和电刺激所造成的癫痫活动中，其表达很显著。c-fos和fos的大量表达将干细胞核的修复功能而使细胞走向凋亡。1987年Dragunow和Robertson在研究过程中首次发现，电刺激诱导的癫痫活动能够快速而短哲的使大鼠齿状回颗粒细胞核内的c-fos蛋白免疫反应活性增强。在神经系统中，c-fos蛋白的表达程度与癫痫所致的神经元活动程度有关。而且c-fos蛋白的表达情况也随着发作后时间间隔的变化而变化，Wagner等报道，c-fos在大鼠缺血缺氧96 h可以高表达并且持续较长时间，推断其原因可能为缺血缺氧导致神经元迟发性坏死所致
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本实验成功诱发癫痫持续状态模型，并对c-fos蛋白表达时程作初步研究。结果显示在1h的癫痫持续状态结束后6 h及1d，在大鼠海马及颞叶皮层c-fos蛋白表达显著；大鼠癫痫持续状态后3d，海马结构及皮层c-fos免疫反应阳性细胞明显表达；大鼠癫痫持续状态后7d，海马结构及皮层c-fos免疫反应阳性细胞极少数表达，接近对照组。本研究结果显示癫痫持续状态后如小采取干预措施，脑内神经元损伤将持续较长时间。实验结果与以往研究比较，c-fos蛋白表达显著和表达时间较长，可能与以下因素有关：①所选择的模型不同，以往研究选用的是杏仁核电刺激诱发癫痫；②癫痫持续状态的时间和强度不同，本实验癫痫持续状态大鼠发作均达到Racine 4、5纵发作，持续时间达1h，Kondralyev等研究证实癫痫持续状态超过30min，神经元就会坏化。本实验中c-fos蛋白表达时间延长可能与神经元坏死有关；③所选择的动物不同，本实验选择的大鼠为2月龄雄性大鼠，体重200g～250g，较易诱发癫痫持续状态
fos蛋白或c-fos mRNA的表达作为中枢神经系统功能活动的代谢性标志物，对于研究癫痫持续状态神经元的损伤机制损伤持续时间有重要的意义，可为进行干预措施提供依据。目前，fos蛋白或c-fosmRNA已广泛应用于对癫痫的定位研究，探讨癫痫发生的机制，抗癫药物的筛选和评价，随着分子生物学和免疫化学实验技术的发展，c-fos/fos的表达定量会更加精确，无论单独应用还是与其他方法合用，都有重要的参号价值，将会在癫痫的研究中发挥更大的作用。
作者简介：薛国芳(1976—)，女，在读硕士，现工作于山西医科大学第二医院(邮编：030001)；郑辑英、李光来、王荔，工作于山西医科大学第二医院；刘勇，现为日本国立弘前大学医学部在读博士
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